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ds1986080607

新虫 (初入文坛)

[求助] NC膜半干转膜 已有2人参与

本人最近western试验很不顺利，PVDF转膜后marker和泳道都很淡，漂洗之后marker什么的都看不见了，最后显影什么也没有。目的蛋白65KD， 用bio-rad半干转，15V，转膜时间60~90min都试过，估计问题还是出在转膜上，想用NC膜试试，听说NC膜容易转穿，有没有虫友用NC膜做过半干转，交流一下转膜经验啊，
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1楼 2013-12-19 15:18:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ds1986080607 at 2013-12-20 14:31:39
感谢哈，胶膜滤纸都一般大，滤纸是bio-rad的 western paper，比普通的滤纸厚很多（估计要0.3mm多），平时转膜的时候就上下各用一张，普通的滤纸没有用过，电流的话从转膜开始从400MA会一直降到100多，一直在下降， ...

做blot本来就是要用3MM的whatman paper。半干转移需要上下各4张滤纸，湿法是上下各一张。转膜时如果用稳压，电流一般会有一些变化，不会这么多。如果不是稳压，电压会逐渐变小，电流也会变小，小的程度比电压多一些。
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ds1986080607
4楼2013-12-21 00:50:52
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
半干转移不像湿法，需要滤纸、膜、胶的大小一样，否则转移效率很差。你的15v电流是多少？通常半干转移都是做稳流，根据胶的面积计算电流的。NC膜的条件与PVDF差不多，只是膜比较脆，容易破。
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ds1986080607
2楼2013-12-19 15:55:52
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ds1986080607

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-19 15:55:52
半干转移不像湿法，需要滤纸、膜、胶的大小一样，否则转移效率很差。你的15v电流是多少？通常半干转移都是做稳流，根据胶的面积计算电流的。NC膜的条件与PVDF差不多，只是膜比较脆，容易破。

感谢哈，胶膜滤纸都一般大，滤纸是bio-rad的 western paper，比普通的滤纸厚很多（估计要0.3mm多），平时转膜的时候就上下各用一张，普通的滤纸没有用过，电流的话从转膜开始从400MA会一直降到100多，一直在下降，问题会不会出在电流上？
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3楼2013-12-20 14:31:39
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ds1986080607

新虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-12-21 00:50:52
做blot本来就是要用3MM的whatman paper。半干转移需要上下各4张滤纸，湿法是上下各一张。转膜时如果用稳压，电流一般会有一些变化，不会这么多。如果不是稳压，电压会逐渐变小，电流也会变小，小的程度比电压多一些 ...

感谢楼上哈，准备用恒流 面积*2.5ma，转个40min分钟再试试，豁出去了，哈哈哈，
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5楼2013-12-22 23:40:26
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