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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教用PVDF膜做western的朋友
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lzhwin

木虫 (正式写手)

[交流] 请教用PVDF膜做western的朋友已有5人参与

近来开始学做western，没想到居然会卡到转膜这一步。
我用的是PVDF膜，开始几次怎么都转不出来原因分析如下：

前两次认为是没有事先用纯甲醇浸泡，结果立春红S染色空无一物，而且滤纸剪的太大怀疑短路了

第三次PVDF在甲醇里泡了15秒，然后又在含20%甲醇的转膜液中泡了至少10分钟，滤纸比膜小、膜比胶3小。结果立春红还是什么都没染出来。

第四次换用NC膜，正常转膜、膜比胶稍大一点、滤纸比膜小，染出了条带

第五次PVDF在甲醇里泡了3分钟，转膜液里至少15分钟，转完仍然什么都染不出来，绝望下又在甲醇里泡了1分钟，再染色，出了条带。

第六次条件基本同第五次，只是转膜时间比第五次长了一个小时（中间吃饭去了），结果却重复不出第五次的结果，继续向下作ECL显色也没有压出条带。

真是快疯了，为什么在我这里PVDF膜这么难伺候，不都说PVDF膜比NC膜贵也比NC膜好吗？为什么我连转膜这事情都搞不定？大家救救我吧！

PS：转膜是正负极绝对没有搞错
    没有条带的意思是什么都没有，包括marker以及各种高丰度蛋白，统统没有
    转膜的条件是200mA恒流1小时（加冰盒降温），当然具体操作起来时间会有点出入。看不到恒流时的电压值。
    后面几次转过膜的凝胶都重新做过考马斯亮蓝染色，凝胶上已经看不到条带。
   

个人认为膜上什么都没有肯定是关键步骤出了问题，但是到底是哪里呢？郁闷的是我染成功过现在却重复不了了，长一个小时应该不会让蛋白全部穿过PVDF膜吧？
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1楼2008-11-27 18:21:15
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ZOU0000

至尊木虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★
lzhwin(金币+2,VIP+0):谢谢你的建议！ 9-29 20:43
lzhwin(金币+2,VIP+0):谢谢 9-29 20:44
我觉得转膜 的电流太大了，一般转膜的电流应该和膜的大小有关，电流太大产热很多可以破坏蛋白，可以降低转膜的电流条件但增加转膜时间当然这些都要和你具体样品情况而定，样品分子量越小转膜时间越短。这些条件都要在试验过程中摸。
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2楼2008-11-27 20:09:28
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lzhwin

木虫 (正式写手)
我的目的蛋白60K左右，应该很容易转上去，转膜过程中有冰盒降温。PVDF膜应该不容易转穿啊。
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3楼2008-11-27 21:53:05
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wangjiasi

木虫 (正式写手)
★ ★
lzhwin(金币+2,VIP+0):谢谢参与！ 9-29 20:44
不是用nc膜出带了吗？
为什么不用了呢？
电流似乎太大了，短路基本没可能，pvdf膜更容易转穿，减少时间或降低电流试试吧
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4楼2008-12-01 00:06:19
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shadowfly

木虫 (小有名气)
★
lzhwin(金币+1,VIP+0):谢谢！ 9-29 20:45
你的膜面积多大？60K左右的蛋白的话，一般按照每平方厘米1mA转1小时就可以，效果应该还不错
还有，PVDF膜在甲醇里多泡一段时间，10~15分钟吧，使其充分活化。
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5楼2008-12-01 11:40:39
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轻5飞扬

金虫 (正式写手)
★
lzhwin(金币+1,VIP+0):谢谢！ 9-29 20:45
我们用湿转恒压,转的很好,PVDF较NC还是有很大优势的,你可以试试,恒压80V
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6楼2008-12-01 11:44:17
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lzhwin

木虫 (正式写手)
恒压也试过了，100V一个小时 冰盒降温，并且跑胶时点了预染marker。结果，转完膜预染marker既没在膜上也没在胶上，立春红染色，也只有很淡的几条带。个人觉得还是PVDF膜没有处理好。
我是按handbook上做的啊：甲醇处理10秒  水洗5次每次一分钟，只是感觉洗的时候膜有很强的疏水性，基本是漂在液面上的
请问处理好的PVDF膜有什么特点吗？

PS：今天又用NC膜转了一次预染marker很清晰。自己却很郁闷为什么PVDF怎么搞都不行 NC膜怎么搞都能出来。我们实验室PVDF膜还有一大卷 NC膜却没有了。而且PVDF膜不应该很好用吗？（我的PVDF膜孔径是0.45微米）
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7楼2008-12-01 14:33:22
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guxinhan123

银虫 (正式写手)
★ ★
lzhwin(金币+2,VIP+0):谢谢！ 9-29 20:44
我在实验室做Western用PVDF，只在甲醇里稍微润湿一下就行了，转移中低电压高电流，我们一般设为25伏400毫安，尽量保持电流高。外槽放谁就行了，没必要放冰，温度低了SDS还会析出

[ Last edited by guxinhan123 on 2008-12-2 at 10:02 ]
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8楼2008-12-02 10:01:08
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shirlyding

新虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我觉得你可以试试0.2的PVDF膜 我上午就转了一次 没出来 换了小孔径 就没转穿了 还比较满意 我的蛋白也是50多
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9楼2011-03-18 09:35:46
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leilaye

铜虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
8楼: Originally posted by guxinhan123 at 2008-12-02 10:01:08:
我在实验室做Western用PVDF，只在甲醇里稍微润湿一下就行了，转移中低电压高电流，我们一般设为25伏400毫安，尽量保持电流高。外槽放谁就行了，没必要放冰，温度低了SDS还会析出
[ Last edited by guxinhan123 ...

甲醇质量不好会影响吗？
不过丽春红染了，条带清晰，就是34kd到43kd一段好像很少蛋白。。
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10楼2012-02-16 15:29:53
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