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lzhwin木虫 (正式写手)
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请教用PVDF膜做western的朋友 已有5人参与
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近来开始学做western，没想到居然会卡到转膜这一步。 我用的是PVDF膜，开始几次怎么都转不出来原因分析如下： 前两次认为是没有事先用纯甲醇浸泡，结果立春红S染色空无一物，而且滤纸剪的太大怀疑短路了 第三次PVDF在甲醇里泡了15秒，然后又在含20%甲醇的转膜液中泡了至少10分钟，滤纸比膜小、膜比胶3小。结果立春红还是什么都没染出来。 第四次换用NC膜，正常转膜、膜比胶稍大一点、滤纸比膜小，染出了条带 第五次PVDF在甲醇里泡了3分钟，转膜液里至少15分钟，转完仍然什么都染不出来，绝望下又在甲醇里泡了1分钟，再染色，出了条带。 第六次条件基本同第五次，只是转膜时间比第五次长了一个小时（中间吃饭去了），结果却重复不出第五次的结果，继续向下作ECL显色也没有压出条带。 真是快疯了，为什么在我这里PVDF膜这么难伺候，不都说PVDF膜比NC膜贵也比NC膜好吗？为什么我连转膜这事情都搞不定？大家救救我吧！ PS：转膜是正负极绝对没有搞错 没有条带的意思是什么都没有，包括marker以及各种高丰度蛋白，统统没有 转膜的条件是200mA恒流1小时（加冰盒降温），当然具体操作起来时间会有点出入。看不到恒流时的电压值。 后面几次转过膜的凝胶都重新做过考马斯亮蓝染色，凝胶上已经看不到条带。 个人认为膜上什么都没有肯定是关键步骤出了问题，但是到底是哪里呢？郁闷的是我染成功过现在却重复不了了，长一个小时应该不会让蛋白全部穿过PVDF膜吧？ |
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