| 查看: 1048 | 回复: 1 | ||
[求助]
求助！！！大肠杆菌red重组出了问题
|
| 我用red重组系统想将一个基因敲入到BL21（DE3）中去，先是将电转后含有pKD46的菌在30度培养过夜，隔天接500ul到50ml三角瓶中等OD等于02时加入2ml 1M的ara诱导至OD=0.6，诱导了1h20min，之后冰上放置30min，4000g离心5min，再用10%甘油洗3遍，最后重悬于500ul10%甘油，100ul分装。再在做好的感受态里加了10ul线性DNA，浓度300ng/ul，长度10kb，用的是全式金的fastpfu，是直接从质粒上pcr下来的，没有做胶回收，直接试剂盒纯化。混匀冰上放30min后电转，0.4cm电击杯，2500V，5ms，马上加入1mlLB，37度摇1.5h后全部涂板，结果今天长成片了。我导入的线性DNA含有潮霉素抗性基因，lacZ和sacB，在200ug/ml hyg，80ug/ml x-gal的平板上全是蓝色的根本没法挑单菌落。BL21(DE3)的敲除效率不是极低吗，怎么会这样？是不是因为我没做胶回收，pcr片段里有质粒才这样的，但是上次转pKD46进去的时候也是全涂但是就长了2个菌落出来 |
回复此楼» 猜你喜欢
不合理蛙科研实验中的趣事：实验器材的 “乌龙”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验中的趣事：和实验材料的 “斗智斗勇”
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有74人回复
-
蛋白质检测：精准分析，解锁生物分子的密码
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之小鼠实验：严谨设计，解析生命机制的重要载体
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之重金属检测：精准筛查，守护健康与环境的防线
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“蛙测重金属我背锅三千”
已经有0人回复
-
不合理蛙科研实验之“鼠逃三次我发三篇SCI”
已经有0人回复
-
纳米粒度分析
已经有3人回复
-
林科院林化所招收材料与化工专业硕士，坐标南京
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
- 求助~~~~大肠杆菌内质粒会不会自行发生同源重组？
已经有11人回复
- Red重组老是不成功，求救
已经有49人回复
- 求助大肠杆菌噬菌体问题
已经有4人回复
- 基因敲除的假阳性问题
已经有15人回复
- 大肠杆菌red重组老是得不到正确的转化子，求大神帮助！
已经有3人回复
- 关于带卡那抗性的重组大肠杆菌
已经有3人回复
- 大肠杆菌Red重组法基因敲除求助
已经有6人回复
- 求助：本人准备做一个细菌中某个基因的敲除，想用同源重组的方法做
已经有6人回复
- 求助！大肠杆菌转化不长菌落~
已经有28人回复
- 大肠杆菌超声破碎很久不见澄清仍是白色的
已经有21人回复
- 观察大肠杆菌形貌问题
已经有8人回复
- 求助：大肠杆菌基因组的提取
已经有6人回复
- 大肠杆菌转化求助
已经有3人回复
- 【求助/交流】LB平板的问题
已经有21人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌基因组提取
已经有4人回复
- 【求助/交流】请教致病性大肠杆菌是革兰氏阴性还是阳性？
已经有10人回复
- 【求助/交流】关于大肠杆菌的形态
已经有5人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌抗性
已经有12人回复
- 【求助/交流】大肠杆菌BL21的问题
已经有4人回复
- 【求助/交流】请教关于大肠杆菌lamda RED重组问题
已经有23人回复
domopal
铁杆木虫 (正式写手)
- 应助: 1 (幼儿园)
- 金币: 5507.1
- 红花: 1
- 帖子: 326
- 在线: 152.9小时
- 虫号: 2981289
- 注册: 2014-02-20
- 性别: GG
- 专业: 微生物遗传学
2楼2017-07-26 08:57:58
10