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[求助]
求助！！！大肠杆菌red重组出了问题
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| 我用red重组系统想将一个基因敲入到BL21（DE3）中去，先是将电转后含有pKD46的菌在30度培养过夜，隔天接500ul到50ml三角瓶中等OD等于02时加入2ml 1M的ara诱导至OD=0.6，诱导了1h20min，之后冰上放置30min，4000g离心5min，再用10%甘油洗3遍，最后重悬于500ul10%甘油，100ul分装。再在做好的感受态里加了10ul线性DNA，浓度300ng/ul，长度10kb，用的是全式金的fastpfu，是直接从质粒上pcr下来的，没有做胶回收，直接试剂盒纯化。混匀冰上放30min后电转，0.4cm电击杯，2500V，5ms，马上加入1mlLB，37度摇1.5h后全部涂板，结果今天长成片了。我导入的线性DNA含有潮霉素抗性基因，lacZ和sacB，在200ug/ml hyg，80ug/ml x-gal的平板上全是蓝色的根本没法挑单菌落。BL21(DE3)的敲除效率不是极低吗，怎么会这样？是不是因为我没做胶回收，pcr片段里有质粒才这样的，但是上次转pKD46进去的时候也是全涂但是就长了2个菌落出来 |
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domopal
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