应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达引物设计求助~
61/1返回列表
查看: 2826  |  回复: 5
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

pink3sky

木虫 (小有名气)

[求助] 原核表达引物设计求助~ 已有2人参与

准备设计蛋白全基因序列的其中一部分序列构建原核表达载体，选择的载体是pGEX-6p-1，想插入的酶切位点是BamH1和Xho1，设计的引物是正向引物：5’-GGATCCGGGTATTGAAAGTGCCGAGAT-3’;反向引物：5’-CTCGAGTGACAGTGACTGCTGCTATGTG-3’，插入的序列预计是400个碱基（另外一对设计的引物插入序列是780个碱基）。
我想请教各位的是：
1、需要在酶切位点前插入保护碱基吗？
2、这样设计会导致移码突变吗？因为我的反向引物不是3的倍数，减掉2个碱基才能跟后面的成3个碱基翻译成正确的氨基酸。现在怎么解决？看到很多解答还是看不明白，插入酶切位点的序列可以通过载体的ATG起始，怎么才能避免造成移码突变？
3、在反向引物插入的TGA终止密码子可以正确翻译成终止子吗？
4、插入的400个碱基或780个碱基会不会不太好插入，之前把设计的引物上插入酶切位点插反了，可以用吗？正向引物 5’-CTCGAGGGGTATTGAAAGTGCCGAGAT-3’;反向引物：5’-GGATCCTGACAGTGACTGCTGCTATGTG-3’会不会表达出来的序列就不是想要的序列了？
由于自己刚接触引物设计这方面的试验，有些部分弄得不明白，所以请较各位，谢谢各位耐心的解答，十分感谢！
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

蛋白表达纯化鉴定精华 实验交流

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-12-12 16:47:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-13 00:14:01
sense primer：保护碱基+酶切位点+互补序列（正向序列）
antisense primer: 保护碱基+酶切位点+（stop codon反向互补序列）+互补序列（反向互补序列）
两个“互补序列”之间当然必须是三的倍数。
如果N端酶切位点不是in frame 的，可以在酶切位点后加1或2个碱基调整。
赞一下(2人) 回复此楼
2楼2013-12-12 23:55:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

mondy1981

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-13 00:14:08
pink3sky: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 回答的非常完全！O(∩_∩)O谢谢 2013-12-13 09:37:16
1.酶切位点前加上2-3个碱基作为保护，譬如AAA or TTT
2.然后看GGATCC后面是否在阅读框内，不在的话加1or 2个碱基，保证你的表达序列阅读框没问题，另外你是否需要在‘GGGTATTGAAAGTGCCGAGAT“加上ATG作为起始密码子？如果你酶切位点也包含在翻译序列内就无需加（即ATGxxxGGATCC加上你的基因，你也要保证是正确的氨基酸序列开始这里），否则你要加的。
3.你插入序列当然是要3倍数，否则最后一个氨基酸不会被正确翻译，在最后一个氨基酸后加上TGA or TAA都行，当然要保证stop coden也是在阅读框内的。反向引物中终止子是5’TCA...'3'
4.几百个碱基很容易就连上了，很简单的分子克隆。
5。酶切位点弄反需要重新设计订引物
赞一下(2人) 回复此楼
3楼2013-12-13 00:13:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pink3sky

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mondy1981 at 2013-12-13 00:13:21
1.酶切位点前加上2-3个碱基作为保护，譬如AAA or TTT
2.然后看GGATCC后面是否在阅读框内，不在的话加1or 2个碱基，保证你的表达序列阅读框没问题，另外你是否需要在‘GGGTATTGAAAGTGCCGAGAT“加上ATG作为起始密码子 ...

你好 再请教您一下 就是我的pGEX-6p-1载体上GST：258-992； pGEX_3_primer：1056-1034 BamHI：945； XhoI：969；我在设计上游引物时还需要加启动子对应碱基不，会不会表达出来不是我需要的序列？谢谢
赞一下 回复此楼
4楼2013-12-18 09:32:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Huobol
5楼2016-11-24 21:04:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

宠儿小虫

禁虫
本帖内容被屏蔽
6楼2021-07-25 13:34:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 pink3sky 的主题更新
61/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭