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pink3sky木虫 (小有名气)
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[求助]
原核表达引物设计求助~ 已有2人参与
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准备设计蛋白全基因序列的其中一部分序列构建原核表达载体，选择的载体是pGEX-6p-1，想插入的酶切位点是BamH1和Xho1，设计的引物是正向引物：5’-GGATCCGGGTATTGAAAGTGCCGAGAT-3’;反向引物：5’-CTCGAGTGACAGTGACTGCTGCTATGTG-3’，插入的序列预计是400个碱基（另外一对设计的引物插入序列是780个碱基）。 我想请教各位的是： 1、需要在酶切位点前插入保护碱基吗？ 2、这样设计会导致移码突变吗？因为我的反向引物不是3的倍数，减掉2个碱基才能跟后面的成3个碱基翻译成正确的氨基酸。现在怎么解决？看到很多解答还是看不明白，插入酶切位点的序列可以通过载体的ATG起始，怎么才能避免造成移码突变？ 3、在反向引物插入的TGA终止密码子可以正确翻译成终止子吗？ 4、插入的400个碱基或780个碱基会不会不太好插入，之前把设计的引物上插入酶切位点插反了，可以用吗？正向引物 5’-CTCGAGGGGTATTGAAAGTGCCGAGAT-3’;反向引物：5’-GGATCCTGACAGTGACTGCTGCTATGTG-3’会不会表达出来的序列就不是想要的序列了？ 由于自己刚接触引物设计这方面的试验，有些部分弄得不明白，所以请较各位，谢谢各位耐心的解答，十分感谢！ |
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 蛋白表达纯化鉴定精华 | 实验交流 |
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6楼2021-07-25 13:34:15
lihe131
至尊木虫 (文坛精英)
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2楼2013-12-12 23:55:46
【答案】应助回帖
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1.酶切位点前加上2-3个碱基作为保护，譬如AAA or TTT 2.然后看GGATCC后面是否在阅读框内，不在的话加1or 2个碱基，保证你的表达序列阅读框没问题，另外你是否需要在‘GGGTATTGAAAGTGCCGAGAT“加上ATG作为起始密码子？如果你酶切位点也包含在翻译序列内就无需加（即ATGxxxGGATCC加上你的基因，你也要保证是正确的氨基酸序列开始这里），否则你要加的。 3.你插入序列当然是要3倍数，否则最后一个氨基酸不会被正确翻译，在最后一个氨基酸后加上TGA or TAA都行，当然要保证stop coden也是在阅读框内的。反向引物中终止子是5’TCA...'3' 4.几百个碱基很容易就连上了，很简单的分子克隆。 5。酶切位点弄反需要重新设计订引物 |
3楼2013-12-13 00:13:21
pink3sky
木虫 (小有名气)
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4楼2013-12-18 09:32:58
