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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达引物设计求助~
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pink3sky

木虫 (小有名气)

[求助] 原核表达引物设计求助~ 已有2人参与

准备设计蛋白全基因序列的其中一部分序列构建原核表达载体，选择的载体是pGEX-6p-1，想插入的酶切位点是BamH1和Xho1，设计的引物是正向引物：5’-GGATCCGGGTATTGAAAGTGCCGAGAT-3’;反向引物：5’-CTCGAGTGACAGTGACTGCTGCTATGTG-3’，插入的序列预计是400个碱基（另外一对设计的引物插入序列是780个碱基）。
我想请教各位的是：
1、需要在酶切位点前插入保护碱基吗？
2、这样设计会导致移码突变吗？因为我的反向引物不是3的倍数，减掉2个碱基才能跟后面的成3个碱基翻译成正确的氨基酸。现在怎么解决？看到很多解答还是看不明白，插入酶切位点的序列可以通过载体的ATG起始，怎么才能避免造成移码突变？
3、在反向引物插入的TGA终止密码子可以正确翻译成终止子吗？
4、插入的400个碱基或780个碱基会不会不太好插入，之前把设计的引物上插入酶切位点插反了，可以用吗？正向引物 5’-CTCGAGGGGTATTGAAAGTGCCGAGAT-3’;反向引物：5’-GGATCCTGACAGTGACTGCTGCTATGTG-3’会不会表达出来的序列就不是想要的序列了？
由于自己刚接触引物设计这方面的试验，有些部分弄得不明白，所以请较各位，谢谢各位耐心的解答，十分感谢！
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1楼 2013-12-12 16:47:13
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mondy1981

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-13 00:14:08
pink3sky: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 回答的非常完全！O(∩_∩)O谢谢 2013-12-13 09:37:16
1.酶切位点前加上2-3个碱基作为保护，譬如AAA or TTT
2.然后看GGATCC后面是否在阅读框内，不在的话加1or 2个碱基，保证你的表达序列阅读框没问题，另外你是否需要在‘GGGTATTGAAAGTGCCGAGAT“加上ATG作为起始密码子？如果你酶切位点也包含在翻译序列内就无需加（即ATGxxxGGATCC加上你的基因，你也要保证是正确的氨基酸序列开始这里），否则你要加的。
3.你插入序列当然是要3倍数，否则最后一个氨基酸不会被正确翻译，在最后一个氨基酸后加上TGA or TAA都行，当然要保证stop coden也是在阅读框内的。反向引物中终止子是5’TCA...'3'
4.几百个碱基很容易就连上了，很简单的分子克隆。
5。酶切位点弄反需要重新设计订引物
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3楼2013-12-13 00:13:21
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lihe131

至尊木虫 (文坛精英)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-13 00:14:01
sense primer：保护碱基+酶切位点+互补序列（正向序列）
antisense primer: 保护碱基+酶切位点+（stop codon反向互补序列）+互补序列（反向互补序列）
两个“互补序列”之间当然必须是三的倍数。
如果N端酶切位点不是in frame 的，可以在酶切位点后加1或2个碱基调整。
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2楼2013-12-12 23:55:46
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pink3sky

木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by mondy1981 at 2013-12-13 00:13:21
1.酶切位点前加上2-3个碱基作为保护，譬如AAA or TTT
2.然后看GGATCC后面是否在阅读框内，不在的话加1or 2个碱基，保证你的表达序列阅读框没问题，另外你是否需要在‘GGGTATTGAAAGTGCCGAGAT“加上ATG作为起始密码子 ...

你好 再请教您一下 就是我的pGEX-6p-1载体上GST：258-992； pGEX_3_primer：1056-1034 BamHI：945； XhoI：969；我在设计上游引物时还需要加启动子对应碱基不，会不会表达出来不是我需要的序列？谢谢
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4楼2013-12-18 09:32:58
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宠儿小虫

禁虫
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6楼2021-07-25 13:34:15
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