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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 低温诱导蛋白表达时用多少度合适？
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574759350

铁虫 (小有名气)

[求助] 低温诱导蛋白表达时用多少度合适？ 已有1人参与

在做低温诱导蛋白表达时，大家一般用什么温度做诱导，诱导多长时间，所用IPTG浓度是多少？
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1楼 2013-12-04 09:55:45
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

宋晨萌1992

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-04 12:55:05
574759350: 金币+2, ★有帮助 2013-12-04 13:37:49
IPTG 浓度时0.1mM 诱导时间一般24个小时 如果是冷休克载体的话是15度诱导
不同的宿主和载体可能略有差异 可以以上面数据为基点，做个一定范围的探索
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2楼2013-12-04 10:29:49
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574759350

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 随风飘摇11 at 2013-12-04 18:53:12
不同的蛋白，应该是有不同的诱导条件吧？我们有28°，5小时，0.25mMIPTG。也有16度，14小时，0.25mM

如果说28℃诱导20h的话会不会蛋白发生降解？
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10楼2013-12-05 08:17:49
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Ailly950

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

好久的贴了，最近在做这个实验，看了上面的讨论有所收获，谢谢~~希望质粒顺利表达~~~
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16楼2015-03-15 19:18:26
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普通回帖

zilinweizhu

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-04 12:55:12
574759350: 金币+1, ★有帮助 2013-12-04 13:38:01
我以前做的大肠，16度诱导10-15小时，IPTG浓度0.1-1mM都可以。只作为参考，不同的宿主和载体可能会有差别
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3楼2013-12-04 12:21:18
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clcl88

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你更多精彩。 2013-12-04 12:55:20
574759350: 金币+2, ★有帮助 2013-12-04 13:37:28
我们一般是16℃，过夜。IPTG0.5mM
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4楼2013-12-04 12:44:41
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clcl88

银虫 (小有名气)
★
gyesang: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-12-04 14:10:07
更正一下是28℃过夜，IPTG0.5mM，我们一般用载体为pet28b，然后BL21表达
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5楼2013-12-04 12:52:33
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574759350

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by clcl88 at 2013-12-04 12:52:33
更正一下是28℃过夜，IPTG0.5mM，我们一般用载体为pet28b，然后BL21表达

我也是pet28b载体转化的BL21，刚开始用37℃，基本都是包涵体形式，你这样做的效果怎么样？
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6楼2013-12-04 13:37:12
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clcl88

银虫 (小有名气)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-12-04 18:21:00
引用回帖:
6楼: Originally posted by 574759350 at 2013-12-04 13:37:12
我也是pet28b载体转化的BL21，刚开始用37℃，基本都是包涵体形式，你这样做的效果怎么样？...

我们做如果37℃只诱导3-4个小时。形成包涵体的话，有很多因素，下面是我摘抄的他人的一段，仅供参考。
重组蛋白质形成包涵体的机理：1.重组蛋白质的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键。2.外源基因合成太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键的正确配对，同时可能有太多的蛋白质间的非特异性结合、蛋白质局部浓度高于溶解度。3.重组蛋白质的一级结构也与包涵体的形成有关，一般说含硫氨基酸氨基酸多的蛋白质可能易于形成包涵体，含脯氨酸多的蛋白质则明显的与形成包涵体的概率呈正相关，可能是因为脯氨酸破坏螺旋结构，而螺旋结构多位于蛋白质分子表面，有相对较强的机械强度，能够抑制蛋白质分子之间的彼此靠近和相互作用。4.重组蛋白质所处的环境可能不适宜蛋白质形成天然构象，发酵温度较高和pH接近重组蛋白质的等电点时比较容易形成包涵体。
综上述，重组蛋白质形成包涵体不一定需要绝对的巨大的表达量。
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7楼2013-12-04 14:27:46
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Wormhole

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
5楼: Originally posted by clcl88 at 2013-12-04 12:52:33
更正一下是28℃过夜，IPTG0.5mM，我们一般用载体为pet28b，然后BL21表达

pET28b载体，要用BL21(DE3)菌吧
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8楼2013-12-04 17:50:27
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随风飘摇11

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
574759350: 金币+2, ★有帮助 2013-12-05 08:17:09
不同的蛋白，应该是有不同的诱导条件吧？我们有28°，5小时，0.25mMIPTG。也有16度，14小时，0.25mM

[ 发自小木虫客户端 ]
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天道酬勤
9楼2013-12-04 18:53:12
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