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dirkyoung

金虫 (正式写手)

[求助] western的转膜液配方

最近做大蛋白western遇到一点点问题,于是在网上发现了两种转膜液配方。
配方一:Tris 5.8g,甘氨酸 2.9g,SDS 0.376g
配方二:Tris 3.05g,甘氨酸 14.4g
甲醇都是200ml,然后1L定容。
方案二是我们实验室一直在用的,当然会加极少量的SDS,对于100kd一下的蛋白没有问题,200kd以下的勉强能行,200kd以上的之前没人做过,我做了不行。那么这两个配方里甘氨酸为什么差别会这么大呢?或者说这两种方案各有什么适用范围?
另外我还看到说调整甲醇和SDS的含量对于大蛋白的电转有帮助,不知是否如此。
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zhaoxr0311

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
转膜液不加SDS吧,如果蛋白大的话,可以采用湿转啊,效果好些!
2楼2013-11-27 10:41:39
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dirkyoung

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaoxr0311 at 2013-11-27 10:41:39
转膜液不加SDS吧,如果蛋白大的话,可以采用湿转啊,效果好些!

我只有做湿转的条件。我主要问的是这两配方有什么区别,甘氨酸有什么作用。是不是一个湿转,一个半干转的?
3楼2013-11-27 10:46:03
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
dirkyoung: 金币+30, 有帮助 2013-11-28 14:08:51
tris和甘氨酸形成缓冲体系,维系体系的pH。我一直用的是配方一。SDS可以增加蛋白的负电性,调高疏水性蛋白的转膜效果。
4楼2013-11-27 12:40:24
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施子墨

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
dirkyoung: 金币+20 2013-11-28 14:08:54
我用的是配方一~
没问题的
5楼2013-11-27 15:05:49
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yuweiguo138

铁虫 (初入文坛)

我用的是配方2,和milipro给的是一样的,甲醇的浓度20%和10%,不加都试过没太大影响,可能我做过的蛋白都很少有小于30KD的吧。SDS我没加过,我用这个配方做285KD MTOR都试没问题的 。
6楼2014-03-07 17:34:22
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dirkyoung

金虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by yuweiguo138 at 2014-03-07 17:34:22
我用的是配方2,和milipro给的是一样的,甲醇的浓度20%和10%,不加都试过没太大影响,可能我做过的蛋白都很少有小于30KD的吧。SDS我没加过,我用这个配方做285KD MTOR都试没问题的 。

麻烦问一下你一般转多久,电压或者电流大概多少。我现在一般250mA恒流3小时,没什么太大问题。不知你的条件什么样子。
7楼2014-03-08 11:03:43
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