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514278815

木虫 (小有名气)

[求助] 原核表达蛋白复性的具体方案

原核表达复性做了一个月了,纯出来的量很少,希望虫友们给点建议吧,最好有详细的步骤;
   由于需要的蛋白量较大,我才用的是柱复性;包涵体超声破碎后,用洗涤液洗好后重溶到含8M尿素的缓冲液中;复性采用梯度复性8M-2M的梯度在superdex-75上复性;复性后进行透析,透析时出现沉淀,开始怀疑透析梯度大过快了,就采用柱上缓慢换液,发现换液效果不好,真正到达目的缓冲液的蛋白很少;怀疑蛋白在柱子上析出来了。希望虫友给些建议吧,目前怀疑蛋白复性效果不佳,希望能给一个合理的柱上复性方案
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

能够是的蛋白质溶解于水溶液不是复性,蛋白质复性首先要有生物活性,SDS变性蛋白质后照样能够使蛋白质溶解!加入表面活性剂可能使得蛋白质溶解于水溶液,但是不一定就是蛋白质复性!
9楼2013-11-04 12:21:31
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shenlin0514

木虫 (正式写手)

无名小虫

【答案】应助回帖

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感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-11-01 11:35:41
514278815: 金币+55 2013-11-01 19:52:18
建议你再分析一下该蛋白的二级结构,是否存在大量的疏水区域,有时添加Tag可以帮助其复性。另外,可以考虑表面活性剂的使用。
Never say never
2楼2013-11-01 10:33:59
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514278815

木虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by shenlin0514 at 2013-11-01 10:33:59
建议你再分析一下该蛋白的二级结构,是否存在大量的疏水区域,有时添加Tag可以帮助其复性。另外,可以考虑表面活性剂的使用。

终于有大哥回复了,序列已经设计好了,没法再弄Tag了,表面活性剂具体的怎么弄呀?
3楼2013-11-01 19:55:16
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欧阳-90

银虫 (小有名气)

你可以使用其他的复性方法吗?比如稀释复性?
4楼2013-11-02 16:40:32
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