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duke188

新虫 (初入文坛)

[求助] 细胞提蛋白做western blot 已有1人参与

我要提取细胞蛋白做western blot,使用6孔板培养细胞,请问高手们:
1.每培养瓶的细胞可以接种几个孔,每孔一般需要细胞数多少,加样多少ml?
2.提蛋白最少需要蛋白的量是多少?
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edwardellen

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-10-31 13:06:02
铺板密度取决于你所养细胞的生长情况,可以做个预实验,铺几个密度,看看从铺板到你做实验哪个密度比较适合,所谓适合,就是细胞长满但是不挤。一般6孔板的一个孔,肿瘤细胞铺2乘10的5次方个,长两天左右,达到10的6次方以上就可以提蛋白做实验了,6孔板一般加2毫升培养基。如按前面所说的密度,提蛋白时6孔板的一个孔把细胞收集后加裂解液60-90微升,电泳时上样20-30微升,蛋白量足够。一般生长速度的细胞,一个T25的瓶长满但不挤的情况下,铺一块6孔板,剩下的继续培养是足够的。新手没做过,最好还是计数,最好测蛋白浓度,认真记录实验条件,以后才有经验,才能粗略估算。祝实验顺利!
5楼2013-10-31 11:03:47
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daibingling

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流! 2013-10-17 10:38:41
接种细胞数量是以阴性孔在药物作用时间后,可以长满为合适。为了保证蛋白量,提蛋白时可以浓点,通过BCA检测蛋白浓度,控制上样蛋白浓度就可以了。
2楼2013-10-17 10:06:20
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duke188

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by daibingling at 2013-10-17 10:06:20
接种细胞数量是以阴性孔在药物作用时间后,可以长满为合适。为了保证蛋白量,提蛋白时可以浓点,通过BCA检测蛋白浓度,控制上样蛋白浓度就可以了。

新手第一次做,给我个大概的量呗
3楼2013-10-17 10:30:59
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daibingling

铁虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by duke188 at 2013-10-17 10:30:59
新手第一次做,给我个大概的量呗...

上样量蛋白20-40微克就可以
4楼2013-10-17 11:40:53
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