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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 细胞提蛋白做western blot
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duke188

新虫 (初入文坛)

[求助] 细胞提蛋白做western blot 已有1人参与

我要提取细胞蛋白做western blot，使用6孔板培养细胞，请问高手们：
1.每培养瓶的细胞可以接种几个孔，每孔一般需要细胞数多少，加样多少ml？
2.提蛋白最少需要蛋白的量是多少？
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1楼 2013-10-17 09:39:47
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duke188

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by daibingling at 2013-10-17 10:06:20
接种细胞数量是以阴性孔在药物作用时间后，可以长满为合适。为了保证蛋白量，提蛋白时可以浓点，通过BCA检测蛋白浓度，控制上样蛋白浓度就可以了。

新手第一次做，给我个大概的量呗
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3楼2013-10-17 10:30:59
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daibingling

铁虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-17 10:38:41
接种细胞数量是以阴性孔在药物作用时间后，可以长满为合适。为了保证蛋白量，提蛋白时可以浓点，通过BCA检测蛋白浓度，控制上样蛋白浓度就可以了。
赞一下 回复此楼
2楼2013-10-17 10:06:20
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daibingling

铁虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by duke188 at 2013-10-17 10:30:59
新手第一次做，给我个大概的量呗...

上样量蛋白20-40微克就可以
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4楼2013-10-17 11:40:53
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edwardellen

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励交流！ 2013-10-31 13:06:02
铺板密度取决于你所养细胞的生长情况，可以做个预实验，铺几个密度，看看从铺板到你做实验哪个密度比较适合，所谓适合，就是细胞长满但是不挤。一般6孔板的一个孔，肿瘤细胞铺2乘10的5次方个，长两天左右，达到10的6次方以上就可以提蛋白做实验了，6孔板一般加2毫升培养基。如按前面所说的密度，提蛋白时6孔板的一个孔把细胞收集后加裂解液60-90微升，电泳时上样20-30微升，蛋白量足够。一般生长速度的细胞，一个T25的瓶长满但不挤的情况下，铺一块6孔板，剩下的继续培养是足够的。新手没做过，最好还是计数，最好测蛋白浓度，认真记录实验条件，以后才有经验，才能粗略估算。祝实验顺利！
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5楼2013-10-31 11:03:47
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