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dingcong1216新虫 (小有名气)
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[求助]
急！3‘race 反转录程序
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第一次做3‘race，师兄告诉我3’race反转录体系是： 5×PrimeScript Buffer(for Real Time) 2μL PrimeScript RT Enzyme Mix I 0.5μL 3'Race aptor 1 μL Total RNA RNase Free dH2O up to 10μL 可是不知道反转录程序是什么，是普通的反转录程序 37度 15min 85度 5S 4度 还是42度 60min 70 度 15min |
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 RACE |
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dingcong1216
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dingcong1216
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yany19900707
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kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-10-20 18:21:19
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-10-20 18:21:19
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● 使用实验样品 RNA 时的实验操作方法1. 反转录反应。反应体系及反应条件如下： ◆ 反应体系: 试剂 使用量 RNA* X μl* 3′ RACE Adaptor（5 μM） 1 μl 5×PrimeScript Buffer 2 μl dNTP Mixture（10 mM each） 1 μl RNase Inhibitor（40 U/μl） 0.25 μl PrimeScript RTase（200 U/μl） 0.25 μl RNase Free dH2O 5.5-X μl Total Volume 10 μl* 一般情况下，Total RNA的使用量为1 μg，Poly(A)+RNA的使用量为50 ng。增加模板RNA的使用量有时会使反应性能下降，不建议使用大于1 μg的Total RNA。 ◆ 反应条件* 42℃, 60 min↓ 70℃, 15 min 反应结束后可以进行下一步实验或将反应液保存于-20℃。* 对于立体结构复杂的基因，可以先将 RNA 变性后再进行反转录反应。具体操作为：首先将 RNA和引物的混合物 70℃变性 10 分钟，冰上急冷，然后再加入反转录反应的其余试剂，进行 42℃、60 分钟的延伸反应。 |
5楼2013-10-20 16:38:43
