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dingcong1216

新虫 (小有名气)

[求助] 急！3‘race 反转录程序

第一次做3‘race，师兄告诉我3’race反转录体系是：
5×PrimeScript Buffer(for Real Time)     2μL
  PrimeScript  RT Enzyme Mix I        0.5μL
3'Race aptor                                     1 μL
Total RNA     
RNase Free  dH2O            up to  10μL
可是不知道反转录程序是什么，是普通的反转录程序
37度   15min
85度   5S
4度
  还是42度  60min
       70 度       15min
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1楼 2013-10-13 10:05:15
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dingcong1216

新虫 (小有名气)
急！下午准备提RNA然后3‘race反转录，在线等，希望大家能够多多给予帮助！
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2楼2013-10-13 10:08:13
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yany19900707

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

反转录程序 就是先把rna变性  然后根据自己的反应体系进行反转录
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NO.1
3楼2013-10-16 16:57:22
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dingcong1216

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by yany19900707 at 2013-10-16 16:57:22
反转录程序 就是先把rna变性  然后根据自己的反应体系进行反转录

嗯，是想知道3‘Race 反转录的条件，现在已经知道了，谢谢了
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4楼2013-10-17 16:43:59
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taozifeifei

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★ ★
kx444555: 金币+4, 鼓励交流 2013-10-20 18:21:19
● 使用实验样品 RNA 时的实验操作方法1. 反转录反应。反应体系及反应条件如下：
◆ 反应体系:
试剂  使用量
RNA* X μl*
3′ RACE Adaptor（5 μM） 1 μl
5×PrimeScript Buffer 2 μl
dNTP Mixture（10 mM each） 1 μl
RNase Inhibitor（40 U/μl） 0.25 μl
PrimeScript RTase（200 U/μl） 0.25 μl
RNase Free dH2O 5.5-X μl
Total Volume 10 μl*
一般情况下，Total RNA的使用量为1 μg，Poly(A)+RNA的使用量为50 ng。增加模板RNA的使用量有时会使反应性能下降，不建议使用大于1 μg的Total RNA。
◆ 反应条件*
42℃, 60 min↓
70℃, 15 min
反应结束后可以进行下一步实验或将反应液保存于-20℃。* 对于立体结构复杂的基因，可以先将 RNA 变性后再进行反转录反应。具体操作为：首先将 RNA和引物的混合物 70℃变性 10 分钟，冰上急冷，然后再加入反转录反应的其余试剂，进行 42℃、60 分钟的延伸反应。
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5楼2013-10-20 16:38:43
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