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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 测序结果不是我想要的片段！很急！！
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okletsgo

新虫 (初入文坛)

[求助] 测序结果不是我想要的片段！很急！！

最近在做克隆，PCR出来后片段进行胶回收，然后连pMD19-T载体，宿主用过Top10和DH5α，送了两次测序（生工），测序引物用的是M13通用引物，我的目的片段600bp左右，结果两次的测序结果都是1000bp的片段，而且NCBI比对了一下得到的都是些很奇怪的片段，什么香菇的核糖体、假单胞菌DNA，都不是我的目的片段，不知道是什么原因。
克隆是我实验的第一部分，做不出来没法继续后续实验，很着急，希望大家帮帮忙。
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1楼 2013-10-08 17:55:04
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呼啸的阳光
2楼2013-10-08 18:35:47
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wencheng1109

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你用大点的浓度的胶跑一下，看看是不是条带没分开。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2013-10-08 19:47:05
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lpzl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-08 21:33:35
你的测序结果有含载体序列么？若有可以去掉载体序列，也可以节选一小段序列去NCBI比对，试试吧。。。
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Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
4楼2013-10-08 20:26:25
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ljj0720

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-10-10 23:57:13
你测序的时候 用的是什么  用菌液还是质粒去测序  包含载体吗 如果包含载体 应该先去除载体序列  然后 剩下的才是你的片段
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5楼2013-10-09 09:08:40
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okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wencheng1109 at 2013-10-08 19:47:05
你用大点的浓度的胶跑一下，看看是不是条带没分开。

条带是单一的，不论是PCR跑胶，还是菌液PCR检测，都是单一条带，而且大小都是600bp，但是测出来就是1000bp的片段
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6楼2013-10-09 09:39:21
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okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lpzl at 2013-10-08 20:26:25
你的测序结果有含载体序列么？若有可以去掉载体序列，也可以节选一小段序列去NCBI比对，试试吧。。。

我把测出来的序列和目的序列做比对，相似性只有35%。。。基本可以断定不是目的序列
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7楼2013-10-09 09:40:42
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okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ljj0720 at 2013-10-09 09:08:40
你测序的时候 用的是什么  用菌液还是质粒去测序  包含载体吗 如果包含载体 应该先去除载体序列  然后 剩下的才是你的片段

谢谢回复。
我用的是菌液，但是拿测出来的序列和我的目的序列做比对，相似性只有35%，基本可以断定测出来的不是我想要的东西了
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8楼2013-10-09 09:42:15
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黑盖儿

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
okletsgo: 金币+5 2013-10-09 11:27:24
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-10 23:57:23
首先先检查一下，你设计的酶切位点在载体上是不是不止一个；其次建议你PCR的时候用高保真性的pfu酶扩增；再次就是检查一下你的模板是不是有问题；最后建议你直接测质粒，不是测菌液。
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我给不了你宝马香车，锦衣玉食，但我会用一辈子去疼你，爱你，保护你
9楼2013-10-09 09:52:45
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okletsgo

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 黑盖儿 at 2013-10-09 09:52:45
首先先检查一下，你设计的酶切位点在载体上是不是不止一个；其次建议你PCR的时候用高保真性的pfu酶扩增；再次就是检查一下你的模板是不是有问题；最后建议你直接测质粒，不是测菌液。

好的，我准备提质粒再送一次测序
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10楼2013-10-09 10:06:54
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