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okletsgo

新虫 (初入文坛)

[求助] 测序结果不是我想要的片段!很急!!

最近在做克隆,PCR出来后片段进行胶回收,然后连pMD19-T载体,宿主用过Top10和DH5α,送了两次测序(生工),测序引物用的是M13通用引物,我的目的片段600bp左右,结果两次的测序结果都是1000bp的片段,而且NCBI比对了一下得到的都是些很奇怪的片段,什么香菇的核糖体、假单胞菌DNA,都不是我的目的片段,不知道是什么原因。
克隆是我实验的第一部分,做不出来没法继续后续实验,很着急,希望大家帮帮忙。
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黑盖儿

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
okletsgo: 金币+5 2013-10-09 11:27:24
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-10-10 23:57:23
首先先检查一下,你设计的酶切位点在载体上是不是不止一个;其次建议你PCR的时候用高保真性的pfu酶扩增;再次就是检查一下你的模板是不是有问题;最后建议你直接测质粒,不是测菌液。
我给不了你宝马香车,锦衣玉食,但我会用一辈子去疼你,爱你,保护你
9楼2013-10-09 09:52:45
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查看全部 18 个回答

wencheng1109

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
你用大点的浓度的胶跑一下,看看是不是条带没分开。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2013-10-08 19:47:05
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lpzl

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-10-08 21:33:35
你的测序结果有含载体序列么?若有可以去掉载体序列,也可以节选一小段序列去NCBI比对,试试吧。。。
Start_everyday_with_a_new_hope,_leave_bad_memories...
4楼2013-10-08 20:26:25
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ljj0720

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流! 2013-10-10 23:57:13
你测序的时候 用的是什么  用菌液还是质粒去测序  包含载体吗 如果包含载体 应该先去除载体序列  然后 剩下的才是你的片段
5楼2013-10-09 09:08:40
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