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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » race实验 载体测序 获得的片段不是目的片段
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yangcaoqing

新虫 (小有名气)

[交流] race实验 载体测序 获得的片段不是目的片段

初次做race实验，在测序方面遇到了好多问题，希望各位高手能帮我分析分析。
1 一个基因连载体后测序一般都送几个菌落呢？我送了两三个菌落，测序结果为什么不一样呢？备注：都可以找到GSP引物和AUAP引物。
2 测序后跟目的基因比对，前100bp可以比对上，后面几百的bp就比对不上了，这是为什么呢？
3 同一个基因，我已经换了三条GSP内层引物了，每次测序回来都不是我要的基因序列，有什么解决这种问题的办法呢？

谢谢各位啊！
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1楼 2012-06-26 11:02:09
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yangcaoqing

新虫 (小有名气)
木有人理我...
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2楼2012-06-27 10:56:44
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wcg129

禁虫 (著名写手)
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小丹木木: 金币+2, 股交流 2012-06-27 13:45:53
yangcaoqing: 金币+5, 终于有人回帖了 谢谢啊 2012-06-27 15:52:33
本帖内容被屏蔽
3楼2012-06-27 13:13:15
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yangcaoqing

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wcg129 at 2012-06-27 13:13:15
我送了两三个菌落，测序结果为什么不一样呢？备注：都可以找到GSP引物和AUAP引物。
这个可以再提高退火温度试试

还有你扩的基因是什么类型基因，如果是诱导型表达的最好诱导后增强其表达再提取RNA再做

内层扩增我做过梯度检测，每个梯度条带都很明亮而且单一；另外，不是诱导型表达的基因。菌落PCR检测时用的是GSP内层引物和AUAP，扩出来的条带和内层PCR扩增的条带一致。想请教下问题还有可能出在哪里呢？
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4楼2012-06-27 15:58:25
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wcg129

禁虫 (著名写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
yangcaoqing: 金币+1, 3ks 2012-06-28 17:04:33
本帖内容被屏蔽
5楼2012-06-27 16:03:47
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tulip1213

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-28 16:02:21
yangcaoqing: 金币+1, 谢谢 我重新设计引物试一下 2012-06-28 17:14:01
重新设计引物吧。估计你的引物有问题。做RACE前先用兼并引物扩目的片段，如果是基因家族，这些目的片段的序列都不会相同（除去引物），设计RACE引物时，避开原先的引物。内引物与外引物相差100-200bp为妙。
引物设计不好会影响结果。换引物吧。

我一般只送一个菌落。如果你送了3个菌落，测序结果都不一样，只能说明你设计的引物有问题。发生了错配。。。。。
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6楼2012-06-28 15:14:58
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2zongyou

铜虫 (正式写手)
★ ★
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yangcaoqing: 金币+1, 3ks 2012-06-28 17:15:54
我也认为你还是重新设计引物，提高退火，用tuch down 扩增，如果是3‘端直接就能扩增出来
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7楼2012-06-28 15:50:30
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yangcaoqing

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-06-28 15:14:58
重新设计引物吧。估计你的引物有问题。做RACE前先用兼并引物扩目的片段，如果是基因家族，这些目的片段的序列都不会相同（除去引物），设计RACE引物时，避开原先的引物。内引物与外引物相差100-200bp为妙。
引物设 ...

3‘一般能扩增多长呢？为什么我扩了700bp,测序的结果只有前100bp左右是目的片段的序列，后面的就比对不上了呢？
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8楼2012-06-28 17:15:29
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tulip1213

银虫 (小有名气)
★ ★
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yangcaoqing: 金币+1, 3ks 2012-06-30 08:51:36
做3-RACE，我都是自己设计接头引物，不用试剂盒。能扩1200bp以上，然后将测序结果上NCBI比对。就知道你的扩的序列是否正确。
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10楼2012-06-29 15:32:53
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yangcaoqing

新虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by tulip1213 at 2012-06-29 15:32:53
做3-RACE，我都是自己设计接头引物，不用试剂盒。能扩1200bp以上，然后将测序结果上NCBI比对。就知道你的扩的序列是否正确。

你扩增的时候用的酶及buffer有什么特殊要求么，有没有试过用mix扩呢？
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11楼2012-06-30 08:53:03
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qingheyouyou9楼
2012-06-28 18:06   回复  
liu2004m12楼
2012-06-30 09:22   回复  
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