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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » race实验 载体测序 获得的片段不是目的片段
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yangcaoqing

新虫 (小有名气)

[交流] race实验 载体测序 获得的片段不是目的片段

初次做race实验，在测序方面遇到了好多问题，希望各位高手能帮我分析分析。
1 一个基因连载体后测序一般都送几个菌落呢？我送了两三个菌落，测序结果为什么不一样呢？备注：都可以找到GSP引物和AUAP引物。
2 测序后跟目的基因比对，前100bp可以比对上，后面几百的bp就比对不上了，这是为什么呢？
3 同一个基因，我已经换了三条GSP内层引物了，每次测序回来都不是我要的基因序列，有什么解决这种问题的办法呢？

谢谢各位啊！
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1楼 2012-06-26 11:02:09
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tulip1213

银虫 (小有名气)
★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-06-28 16:02:21
yangcaoqing: 金币+1, 谢谢 我重新设计引物试一下 2012-06-28 17:14:01
重新设计引物吧。估计你的引物有问题。做RACE前先用兼并引物扩目的片段，如果是基因家族，这些目的片段的序列都不会相同（除去引物），设计RACE引物时，避开原先的引物。内引物与外引物相差100-200bp为妙。
引物设计不好会影响结果。换引物吧。

我一般只送一个菌落。如果你送了3个菌落，测序结果都不一样，只能说明你设计的引物有问题。发生了错配。。。。。
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6楼2012-06-28 15:14:58
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yangcaoqing

新虫 (小有名气)
木有人理我...
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2楼2012-06-27 10:56:44
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wcg129

禁虫 (著名写手)
★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小丹木木: 金币+2, 股交流 2012-06-27 13:45:53
yangcaoqing: 金币+5, 终于有人回帖了 谢谢啊 2012-06-27 15:52:33
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3楼2012-06-27 13:13:15
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yangcaoqing

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wcg129 at 2012-06-27 13:13:15
我送了两三个菌落，测序结果为什么不一样呢？备注：都可以找到GSP引物和AUAP引物。
这个可以再提高退火温度试试

还有你扩的基因是什么类型基因，如果是诱导型表达的最好诱导后增强其表达再提取RNA再做

内层扩增我做过梯度检测，每个梯度条带都很明亮而且单一；另外，不是诱导型表达的基因。菌落PCR检测时用的是GSP内层引物和AUAP，扩出来的条带和内层PCR扩增的条带一致。想请教下问题还有可能出在哪里呢？
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4楼2012-06-27 15:58:25
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