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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】克隆后DNA片段测序 急
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zhangrun0110

铁虫 (初入文坛)

[交流] 【求助/交流】克隆后DNA片段测序 急 已有7人参与

我们做的是对PCR产物进行克隆，用的是宝生物的克隆试剂盒D101A，里面用的是pMD18-T载体，如果要拿去测序的话，需要向测序公司提供什么？还有一个弱弱的问题，我看不太懂他的克隆位点。。。

[ Last edited by zhangrun0110 on 2010-9-16 at 14:41 ]
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1楼 2010-09-16 14:12:08
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wjswj

木虫 (正式写手)

小木虫领金币专业户
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
具体看载体说明书，一般用的测序引物都是T7，T7ter，也不用你提供。最好提供活菌或者纯化好的质粒。
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金币是赌出来的
2楼2010-09-16 14:53:04
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zhangrun0110

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by wjswj at 2010-09-16 14:53:04:
具体看载体说明书，一般用的测序引物都是T7，T7ter，也不用你提供。最好提供活菌或者纯化好的质粒。

我们得到的是菌落，是不是还需要用液体LB培养基培养一下？培养基里是不是还得加抗生素？
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3楼2010-09-16 15:04:06
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一笑35

铁虫 (初入文坛)
★
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说对了，是得继续用加抗生素的LB培养基培养一下，如果长势良好即可拿到测序公司测序。
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努力学习，充实自己！
4楼2010-09-16 15:06:29
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zhangrun0110

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
Originally posted by 一笑35 at 2010-09-16 15:06:29:
说对了，是得继续用加抗生素的LB培养基培养一下，如果长势良好即可拿到测序公司测序。

那我请问下长到什么程度就可以了呢？要用OD值确定吗？培养多长时间？
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5楼2010-09-16 15:08:27
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vivajie

铁虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
只需提供重组好的质粒
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6楼2010-09-16 15:34:44
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wmq682

金虫 (正式写手)
取摇过的菌液就可以了，克隆位点就是插入位点，就是那个酶切位点要连接上你的PCR序列
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7楼2010-09-16 16:41:07
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wmq682

金虫 (正式写手)
你还是看点资料吧，过程要有好几步的
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8楼2010-09-16 16:42:20
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我是果果

新虫 (初入文坛)
★
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挑白色单菌落,用加amp的LB培养基培养,将菌液送去测序即可,注明你的载体类型,测序公司会用通用引物给你测序
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9楼2010-09-16 16:43:38
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wzw04

铁杆木虫 (小有名气)
★
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引用回帖:
Originally posted by zhangrun0110 at 2010-09-16 15:08:27:

那我请问下长到什么程度就可以了呢？要用OD值确定吗？培养多长时间？

长到肉眼能看到可以挑菌为止，然后挑菌，于加入抗生素的LB液体培养基中摇床培养。250rpm摇个3小时，你能看见明显的浑浊，就可以将菌液送去测序了。测序之前你还可以做个菌液PCR，看转化是否成功
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10楼2010-09-16 16:57:31
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