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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白电泳能跑出带来，但是测不出酶活
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zishilanxuan

金虫 (小有名气)

[求助] 蛋白电泳能跑出带来，但是测不出酶活

请教各位大神一个问题，我现在蛋白电泳能跑出我要的条带，但是酶活测不出来，大家有没有遇到这个问题的？谢谢指教……
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1楼 2013-09-29 20:06:59
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超然渡陈

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-30 17:28:37
gyesang: 回帖置顶 2013-09-30 17:28:44
不知道你的蛋白是原核表达的还是从组织中分离纯化的？也不知道你的蛋白是人源还是其它物种的？不管怎么样都应该先用western blotting证明那个是你的蛋白，最好用蛋白的特异抗体，表达的蛋白也可以用蛋白上带有的标签抗体。确认是你的蛋白了才能往后做。只通过跑胶看大小不能说明问题。分离纯化过程蛋白容易变性失活，分离纯化的方法不合适蛋白测不出来活性很正常。原核表达的蛋白没有活性更正常。原核表达的真核来源蛋白不能进行正确的修饰、折叠和加工，没活性太常见了。
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4楼2013-09-30 14:17:08
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普通回帖

alarace

至尊木虫 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-09-30 10:22:07
蛋白条带差不多但不一定就是你要的目的蛋白吧，目的蛋白上有标签吗？或许鉴定一下比较好。
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2楼2013-09-29 21:04:11
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xv1215

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待更详细的解答 2013-09-30 10:22:16
二楼说的对啊，跑不出不代表是，建议进一步验证，另外你是用什么跑的，蛋白是否已经失活？
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3楼2013-09-29 22:24:52
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xl_dut

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-01 17:07:35
在有机体内分子量相近的蛋白很多，不知楼主是否做了验证或者设有空白对照说明确实存在目的蛋白？
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一日之计在于昨天！
5楼2013-09-30 21:59:34
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feilinshiji

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-01 17:07:43
有条带不等于有蛋白，一定要做WB验证。如果你是用原核表达系统，产物必须要复性啊
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6楼2013-10-01 00:45:24
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-10-01 17:07:50
先用western确定你观察到的条带是否就是目的蛋白。如果是，证明有表达。表达出的蛋白是否有活性是另一个问题了。首先你表达的蛋白是否是天然形式，你是否加了标签。有时候加了标签也会影响蛋白的活性和生物功能。其次，你分离蛋白样品时是否采用的是非变性条件。如果是过表达，是否形成了包涵体。你的目的蛋白是否需要结合辅助因子才有活性。
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7楼2013-10-01 01:34:26
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

测定酶活性要在酶的最适条件下测定，如果不是最适条件，有抑制剂（也包括产物抑制和底物浓度过高抑制等），酶分子构象变异等许多条件都可能是酶失活。

能够回收蛋白质与蛋白质有活性之间没有必然联系，回收的蛋白质全是变性的，也是回收了，但是肯定没有活性。
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8楼2013-10-02 20:07:42
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