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blairwang

新虫 (初入文坛)

[求助] 长片段PCR 求助!

第一次做long PCR,用的是 QIAGEN 的 LongRange PCR Kit,号称最长能扩到40K。我不管,一上来就分别针对16K、29K、34K和39K的区域设计了四对引物,引物平均长度25b,Tm 68°左右。其中29K和39K的两对引物,primer blast 的结果特异性较好,另外两个不太好。前后做了两次PCR,退火温度为62°和63°,跑了24 hours 以上,对mg2+、模板、高GC buffer 都进行了梯度实验,最后出来跑胶都没有结果,除了几个较暗的大范围弥散条带。请问大家,还有什么因素是我遗漏的,还是说引物设计的不好。。。
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gufeng2008

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果全部按照试剂盒的条件和程序做,可以咨询QIAGEN!如果不是,自己修改了体系和程序,你的程序和体系写一下?让看看,再分析!
2楼2013-12-04 11:04:11
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