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blairwang

新虫 (初入文坛)

[求助] 长片段PCR 求助！

第一次做long PCR，用的是 QIAGEN 的 LongRange PCR Kit，号称最长能扩到40K。我不管，一上来就分别针对16K、29K、34K和39K的区域设计了四对引物，引物平均长度25b，Tm 68°左右。其中29K和39K的两对引物，primer blast 的结果特异性较好，另外两个不太好。前后做了两次PCR，退火温度为62°和63°，跑了24 hours 以上，对mg2+、模板、高GC buffer 都进行了梯度实验，最后出来跑胶都没有结果，除了几个较暗的大范围弥散条带。请问大家，还有什么因素是我遗漏的，还是说引物设计的不好。。。
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1楼 2013-09-25 16:52:01
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gufeng2008

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

如果全部按照试剂盒的条件和程序做，可以咨询QIAGEN！如果不是，自己修改了体系和程序，你的程序和体系写一下？让看看，再分析！
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2楼2013-12-04 11:04:11
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