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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 实验/技术 » 在做霉菌PCR时，遇到很多问题，求助！！！！
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简佳爱学

新虫 (小有名气)

[求助] 在做霉菌PCR时，遇到很多问题，求助！！！！ 已有1人参与

我最近在做霉菌的分子鉴定，提取DNA用的是真菌DNA提取试剂盒，第一次提取的时候，提取DNA后，电泳检测了浓度，几乎看不到条带，但是PCR的结果还不错。后来，再提取DNA的时候，都没有进行浓度检测，直接PCR扩增，但是，越做效果越不好，80%都扩增不出来。
    今天早上，我把之前提取的DNA进行了电泳检测，条带很暗，或者看不到，但是在这些当中，有的菌虽然DNA浓度低，但是PCR结果还挺好的，所以，我现在不知道问题出在哪里。有没有谁做过或者遇到过这样的问题呢，请多给建议呀！！

PS：我在提取DNA的时候，没有进行研磨，直接刮下孢子粉末，加裂解液，然后就按照试剂盒说明书提取了
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1楼 2013-07-12 10:44:16
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zxbz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助交流！ 2013-07-12 11:31:00
建议提取菌丝的DNA，提取孢子的好提吗？没有尝试过
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2楼2013-07-12 10:49:25
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lmhzy1987

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励交流！ 2013-07-12 11:31:08
楼上说的挺对的，孢子的一般不大好提，而且建议是新鲜的菌丝体
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头疼的文库
3楼2013-07-12 11:04:17
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lipeijun2010

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我们用的是天根的植物提取试剂盒，PDA液体培养基培养3天，液氮研磨，效果还可以，DNA浓度达到50ug/mL
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4楼2013-07-12 11:54:03
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简佳爱学

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zxbz at 2013-07-12 10:49:25
建议提取菌丝的DNA，提取孢子的好提吗？没有尝试过

谢谢

是这样，我是培养在PDA培养基上的，那么刮下来的应该就是孢子吧，怎么获得菌丝呢
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5楼2013-07-12 12:22:40
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简佳爱学

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by lipeijun2010 at 2013-07-12 11:54:03
我们用的是天根的植物提取试剂盒，PDA液体培养基培养3天，液氮研磨，效果还可以，DNA浓度达到50ug/mL

谢谢

我现在用的是bioflux的真菌DNA提取试剂盒，本来想着培养在固体培养基上，可以直接挂下孢子，不用研磨；用液体培养的话，菌体都长在一起，很厚一层，应该要研磨，那请问，您最后在溶解DNA时，用的多少体系呢，PCR时模板一般用多少呢。我现在都是用100ul溶DNA，模板就是2ul，但是有时候能扩增出来，有时候又不好
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6楼2013-07-12 13:00:23
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orangeleaf

铜虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 简佳爱学 at 2013-07-12 13:00:23
谢谢

我现在用的是bioflux的真菌DNA提取试剂盒，本来想着培养在固体培养基上，可以直接挂下孢子，不用研磨；用液体培养的话，菌体都长在一起，很厚一层，应该要研磨，那请问，您最后在溶解DNA时，用的多少体系呢 ...

PDA培养基平板上也可以刮下菌丝的（产孢子前，相对液体培养量少了点）。
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工业酶-T180;AU-400FLD;B85vanguard;E3-1280v3;NH-D9L;8GBx2;R7-250A-ZLH4;Black500GB;EA191M;SK-8115;M111s
7楼2013-07-12 13:09:11
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Petter_JDW

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议稀释20-50倍后 再作模板加入体系中~~~不妨一试
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8楼2013-07-12 19:17:40
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xmckyltwx

木虫 (正式写手)
建议先接种到25毫升三角瓶中，摇菌后再提取DNA，一般用天根的细菌的盒子也能提出来，而且浓度不错~~
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成功的起点是坚信，成功的终点是坚持~~
9楼2013-07-15 09:23:17
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xwkhj

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我们实验室都是直接提菌体的DNA，用 CTAB 的方法！
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妈的，郁闷，帮别人应助文献，结果胶回收跑过了，天不佑我！
10楼2013-07-15 18:44:33
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