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简佳爱学

新虫 (小有名气)

[求助] 在做霉菌PCR时,遇到很多问题,求助!!!! 已有1人参与

我最近在做霉菌的分子鉴定,提取DNA用的是真菌DNA提取试剂盒,第一次提取的时候,提取DNA后,电泳检测了浓度,几乎看不到条带,但是PCR的结果还不错。后来,再提取DNA的时候,都没有进行浓度检测,直接PCR扩增,但是,越做效果越不好,80%都扩增不出来。
    今天早上,我把之前提取的DNA进行了电泳检测,条带很暗,或者看不到,但是在这些当中,有的菌虽然DNA浓度低,但是PCR结果还挺好的,所以,我现在不知道问题出在哪里。有没有谁做过或者遇到过这样的问题呢,请多给建议呀!!

PS:我在提取DNA的时候,没有进行研磨,直接刮下孢子粉末,加裂解液,然后就按照试剂盒说明书提取了
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zxbz

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+2, 鼓励应助交流! 2013-07-12 11:31:00
建议提取菌丝的DNA,提取孢子的好提吗?没有尝试过
2楼2013-07-12 10:49:25
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lmhzy1987

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励交流! 2013-07-12 11:31:08
楼上说的挺对的,孢子的一般不大好提,而且建议是新鲜的菌丝体
头疼的文库
3楼2013-07-12 11:04:17
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lipeijun2010

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我们用的是天根的植物提取试剂盒,PDA液体培养基培养3天,液氮研磨,效果还可以,DNA浓度达到50ug/mL
4楼2013-07-12 11:54:03
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简佳爱学

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by zxbz at 2013-07-12 10:49:25
建议提取菌丝的DNA,提取孢子的好提吗?没有尝试过

谢谢

是这样,我是培养在PDA培养基上的,那么刮下来的应该就是孢子吧,怎么获得菌丝呢
5楼2013-07-12 12:22:40
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简佳爱学

新虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by lipeijun2010 at 2013-07-12 11:54:03
我们用的是天根的植物提取试剂盒,PDA液体培养基培养3天,液氮研磨,效果还可以,DNA浓度达到50ug/mL

谢谢

我现在用的是bioflux的真菌DNA提取试剂盒,本来想着培养在固体培养基上,可以直接挂下孢子,不用研磨;用液体培养的话,菌体都长在一起,很厚一层,应该要研磨,那请问,您最后在溶解DNA时,用的多少体系呢,PCR时模板一般用多少呢。我现在都是用100ul溶DNA,模板就是2ul,但是有时候能扩增出来,有时候又不好
6楼2013-07-12 13:00:23
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orangeleaf

铜虫 (正式写手)

引用回帖:
6楼: Originally posted by 简佳爱学 at 2013-07-12 13:00:23
谢谢

我现在用的是bioflux的真菌DNA提取试剂盒,本来想着培养在固体培养基上,可以直接挂下孢子,不用研磨;用液体培养的话,菌体都长在一起,很厚一层,应该要研磨,那请问,您最后在溶解DNA时,用的多少体系呢 ...

PDA培养基平板上也可以刮下菌丝的(产孢子前,相对液体培养量少了点)。
工业酶-T180;AU-400FLD;B85vanguard;E3-1280v3;NH-D9L;8GBx2;R7-250A-ZLH4;Black500GB;EA191M;SK-8115;M111s
7楼2013-07-12 13:09:11
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Petter_JDW

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议稀释20-50倍后 再作模板加入体系中~~~不妨一试
8楼2013-07-12 19:17:40
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xmckyltwx

木虫 (正式写手)

建议先接种到25毫升三角瓶中,摇菌后再提取DNA,一般用天根的细菌的盒子也能提出来,而且浓度不错~~
成功的起点是坚信,成功的终点是坚持~~
9楼2013-07-15 09:23:17
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xwkhj

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我们实验室都是直接提菌体的DNA,用 CTAB 的方法!
妈的,郁闷,帮别人应助文献,结果胶回收跑过了,天不佑我!
10楼2013-07-15 18:44:33
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