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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » PCR问题--求助啊 ！
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)

[求助] PCR问题--求助啊 ！

最近PCR一直出问题，各方面排除问题，可是还是不行，救助啊！
图1是之前PCR正常的，一天之隔就出不来了，图2 2空是第一步PCR产物稀释10倍的，之后分别为原液（没稀释），稀释30倍，稀释50倍，稀释80倍，怎么都在点样孔旁啊！是什么原因！！！
PCR问题--求助啊  ！
IMG_20130516_123059.jpg


PCR问题--求助啊  ！-1
IMG_20130618_155159.jpg
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haha
1楼 2013-06-18 18:21:18
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

sunnyboylg

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖应助！ 2013-06-18 20:50:58
看样子是目的基因没P出来，都是些杂质。在添加PCR反应体系中是否出现少加或者多加的问题，楼主在重新做几次吧，之前PCR正常说明模板没问题。建议楼主也可以这样试试：最好找一个孔，放一个肯定能P出条带的PCR体系，当然要同步操作，确保你的操作没有失误，如果这个孔能出条带，而其他样品不行，那么多半问题出在你的整个PCR体系，比如模板的质量和浓度，酶的类型和浓度，退火温度，mg离子浓度等等。祝楼主尽早成功。。。
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要么读书，要么旅行，身体和灵魂，必须有一个在路上
2楼2013-06-18 18:56:49
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普通回帖

zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖应助！ 2013-06-18 20:51:05
图1出那么多条带，然后再那产物做PCR，是要做nest PCR么？如果是nest PCR，出现图2的情况可能第二次PCR引物不行，模板浓度也高了，一般PCR产物可以稀释到100~1000倍来做下一轮PCR。
如果不是做nest PCR，用PCR产物做PCR是什么意思？
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每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
3楼2013-06-18 20:46:21
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-06-18 20:46:21
图1出那么多条带，然后再那产物做PCR，是要做nest PCR么？如果是nest PCR，出现图2的情况可能第二次PCR引物不行，模板浓度也高了，一般PCR产物可以稀释到100~1000倍来做下一轮PCR。
如果不是做nest PCR，用PCR产物 ...

是做巢氏PCR，图1是之前做的第二步pcr的电泳图，整套体系都一样，只是图1是做引物浓度影响，之后想再做稀释倍数及其它因素的影响时就出不来了。之后换了dNTP,Taq酶，上一步扩增产物，pcr buffer ,mg2+,结果还是一样啊！
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haha
4楼2013-06-18 21:45:36
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sunnyboylg at 2013-06-18 18:56:49
看样子是目的基因没P出来，都是些杂质。在添加PCR反应体系中是否出现少加或者多加的问题，楼主在重新做几次吧，之前PCR正常说明模板没问题。建议楼主也可以这样试试：最好找一个孔，放一个肯定能P出条带的PCR体系， ...

我觉得是没有少加或者多加啊，已经重复了好几次了，有一次居然阴性对照（没加模版）和其它是一样样的。帮帮忙吧，下一步怎么做。
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haha
5楼2013-06-18 21:48:29
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-06-19 10:53:47
主要是模版多了，。而且降解了。建议稀释模版重做，并且电泳液新配置。。时间也可以长一点
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6楼2013-06-18 23:41:37
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kidchang

至尊木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-06-19 10:53:58
图2看着像是模板量多了 建议稀释模板
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7楼2013-06-19 09:55:38
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)
可是图2第二孔是稀释10倍，第三个孔才是原液，第四个孔开始分别是稀释30,50,80倍啊，如果后面几个孔不和孔三一样的话还有可能是模板浓度大的原因吧？

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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haha
8楼2013-06-19 13:52:52
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hyc_charles

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
1949stone: 金币+1, 那倒是有可能了 再一稀释倍数问题 对于pcr来说 不要害怕模板少 2013-07-16 08:12:11
楼主遇到和我一样的问题，我把预扩产物稀释50×，100×，200×，发现结果还是一样的，说明模板浓度没有太大影响，其余试剂我也都换了，也没有发现问题，基本判断不是PCR体系的问题。目前怀疑之前的酶切连接出了问题
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不但要做一个优秀的人，更要做一个无可取代的人…
9楼2013-07-15 20:43:41
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maidi12

禁虫 (小有名气)
★
1949stone: 金币+1, 阳性对照不同体系摸索的时候不好控制！阴性对照尚可！ 2013-07-16 08:13:08
本帖内容被屏蔽
10楼2013-07-15 20:58:44
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