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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)

[求助] PCR问题--求助啊 ！

最近PCR一直出问题，各方面排除问题，可是还是不行，救助啊！
图1是之前PCR正常的，一天之隔就出不来了，图2 2空是第一步PCR产物稀释10倍的，之后分别为原液（没稀释），稀释30倍，稀释50倍，稀释80倍，怎么都在点样孔旁啊！是什么原因！！！
PCR问题--求助啊  ！
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PCR问题--求助啊  ！-1
IMG_20130618_155159.jpg
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haha
1楼 2013-06-18 18:21:18
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sunnyboylg at 2013-06-18 18:56:49
看样子是目的基因没P出来，都是些杂质。在添加PCR反应体系中是否出现少加或者多加的问题，楼主在重新做几次吧，之前PCR正常说明模板没问题。建议楼主也可以这样试试：最好找一个孔，放一个肯定能P出条带的PCR体系， ...

我觉得是没有少加或者多加啊，已经重复了好几次了，有一次居然阴性对照（没加模版）和其它是一样样的。帮帮忙吧，下一步怎么做。
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haha
5楼2013-06-18 21:48:29
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sunnyboylg

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖应助！ 2013-06-18 20:50:58
看样子是目的基因没P出来，都是些杂质。在添加PCR反应体系中是否出现少加或者多加的问题，楼主在重新做几次吧，之前PCR正常说明模板没问题。建议楼主也可以这样试试：最好找一个孔，放一个肯定能P出条带的PCR体系，当然要同步操作，确保你的操作没有失误，如果这个孔能出条带，而其他样品不行，那么多半问题出在你的整个PCR体系，比如模板的质量和浓度，酶的类型和浓度，退火温度，mg离子浓度等等。祝楼主尽早成功。。。
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要么读书，要么旅行，身体和灵魂，必须有一个在路上
2楼2013-06-18 18:56:49
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zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖应助！ 2013-06-18 20:51:05
图1出那么多条带，然后再那产物做PCR，是要做nest PCR么？如果是nest PCR，出现图2的情况可能第二次PCR引物不行，模板浓度也高了，一般PCR产物可以稀释到100~1000倍来做下一轮PCR。
如果不是做nest PCR，用PCR产物做PCR是什么意思？
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每个年龄都有其最应该做的事，但只有过了那个年龄自己才知道
3楼2013-06-18 20:46:21
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-06-18 20:46:21
图1出那么多条带，然后再那产物做PCR，是要做nest PCR么？如果是nest PCR，出现图2的情况可能第二次PCR引物不行，模板浓度也高了，一般PCR产物可以稀释到100~1000倍来做下一轮PCR。
如果不是做nest PCR，用PCR产物 ...

是做巢氏PCR，图1是之前做的第二步pcr的电泳图，整套体系都一样，只是图1是做引物浓度影响，之后想再做稀释倍数及其它因素的影响时就出不来了。之后换了dNTP,Taq酶，上一步扩增产物，pcr buffer ,mg2+,结果还是一样啊！
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haha
4楼2013-06-18 21:45:36
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