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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)

[求助] PCR问题--求助啊 !

最近PCR一直出问题,各方面排除问题,可是还是不行,救助啊!
图1是之前PCR正常的,一天之隔就出不来了,图2 2空是第一步PCR产物稀释10倍的,之后分别为原液(没稀释),稀释30倍,稀释50倍,稀释80倍,怎么都在点样孔旁啊!是什么原因!!!
PCR问题--求助啊  !
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PCR问题--求助啊  !-1
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by sunnyboylg at 2013-06-18 18:56:49
看样子是目的基因没P出来,都是些杂质。在添加PCR反应体系中是否出现少加或者多加的问题,楼主在重新做几次吧,之前PCR正常说明模板没问题。建议楼主也可以这样试试:最好找一个孔,放一个肯定能P出条带的PCR体系, ...

我觉得是没有少加或者多加啊,已经重复了好几次了,有一次居然阴性对照(没加模版)和其它是一样样的。帮帮忙吧,下一步怎么做。
haha
5楼2013-06-18 21:48:29
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sunnyboylg

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖应助! 2013-06-18 20:50:58
看样子是目的基因没P出来,都是些杂质。在添加PCR反应体系中是否出现少加或者多加的问题,楼主在重新做几次吧,之前PCR正常说明模板没问题。建议楼主也可以这样试试:最好找一个孔,放一个肯定能P出条带的PCR体系,当然要同步操作,确保你的操作没有失误,如果这个孔能出条带,而其他样品不行,那么多半问题出在你的整个PCR体系,比如模板的质量和浓度,酶的类型和浓度,退火温度,mg离子浓度等等。祝楼主尽早成功。。。
要么读书,要么旅行,身体和灵魂,必须有一个在路上
2楼2013-06-18 18:56:49
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zhoulubin

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖应助! 2013-06-18 20:51:05
图1出那么多条带,然后再那产物做PCR,是要做nest PCR么?如果是nest PCR,出现图2的情况可能第二次PCR引物不行,模板浓度也高了,一般PCR产物可以稀释到100~1000倍来做下一轮PCR。
如果不是做nest PCR,用PCR产物做PCR是什么意思?
每个年龄都有其最应该做的事,但只有过了那个年龄自己才知道
3楼2013-06-18 20:46:21
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下雨的傍晚

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by zhoulubin at 2013-06-18 20:46:21
图1出那么多条带,然后再那产物做PCR,是要做nest PCR么?如果是nest PCR,出现图2的情况可能第二次PCR引物不行,模板浓度也高了,一般PCR产物可以稀释到100~1000倍来做下一轮PCR。
如果不是做nest PCR,用PCR产物 ...

是做巢氏PCR,图1是之前做的第二步pcr的电泳图,整套体系都一样,只是图1是做引物浓度影响,之后想再做稀释倍数及其它因素的影响时就出不来了。之后换了dNTP,Taq酶,上一步扩增产物,pcr buffer ,mg2+,结果还是一样啊!
haha
4楼2013-06-18 21:45:36
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