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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达诱导不表达
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无花草

新虫 (初入文坛)

[求助] 原核表达诱导不表达

各位虫友，大家好！小弟初做原核表达，实验室没人做，自己摸索，苦悲啊！最近遇到棘手的问题，请大家帮忙分析下原因？SDS-PAGE电泳如图。我大概说下，就是只有诱导的BL21空菌有总蛋白，转化的空载体（诱导和不诱导）和重组载体（诱导和不诱导）都没有总蛋白表达。大家帮忙分析下可能存在的原因和解决方法吧，谢谢！
原核表达诱导不表达
未命名.jpg
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好好做实验，毕业找份好工作！
1楼 2013-09-23 11:13:47
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15879003030

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

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kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-09-24 08:59:40
无花草: 金币+2, ★有帮助 2013-10-15 10:26:37
总蛋白都看不到  那是不可能的，楼主你最好想办法看到总蛋白先吧。

另外pet-28a我也用过几次    表达量都比较低。如果你也是这样的话，要做纯化可能比较困难。
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2楼2013-09-23 14:46:52
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

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无花草: 金币+2, ★有帮助 2013-10-15 10:26:56
如果表达量只占总蛋白的5%，甚至更低，跑电泳是看不出来的，
最后先跑电泳，然后转膜做western
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行至水穷处，坐看云起时
3楼2013-09-23 15:50:13
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feilinshiji

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-28 02:12:53
楼主的结果很神奇啊，连菌体蛋白都快看不出来了
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4楼2013-09-23 17:33:17
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小黑L小白

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
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你是怎么处理菌的？如何处理样品跑蛋白胶的？
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5楼2013-09-23 19:56:44
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张力民1598

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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gyesang: 金币+1, 鼓励回帖交流！ 2013-09-28 02:13:06
你是怎么提取的蛋白质呢?为什么整个泳道的蛋白这么少呢.感觉细菌没有被裂解一样.
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6楼2013-09-23 20:10:01
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fuyuandj86

版主 (著名写手)

己所不欲，勿施于人

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kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-09-24 08:59:51
无花草: 金币+2, ★有帮助 2013-10-15 10:27:25
SDS-PAGE上样要根据菌液的OD600值调整的.
我一般的做法是,对于OD600=1的1ml菌液,我离心去除上清LB,然后
加50ul 0.5M NaCl和50ul 2X Laemmli loading dye. 上样每个胶孔加 20ul
如果OD600高就多加点NaCl溶液和loading dye
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The doer of good becomes good, the doer of evil becomes evil.
7楼2013-09-23 22:33:23
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guoyanfei

金虫 (小有名气)

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-28 02:13:25
你的先让菌体总蛋白跑出来，你的上样Buffer可能有问题；可能菌体内有完全裂解，所以连菌体蛋白都看不到。
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8楼2013-09-24 08:39:06
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无花草

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 小黑L小白 at 2013-09-23 19:56:44
你是怎么处理菌的？如何处理样品跑蛋白胶的？

将含有构建好的表达载体的宿主菌BL21， 挑取单菌落接种于2ml的LB液体培养基，于37℃活化过夜后，按l：100稀释加入到3mlLB液体培养基中，震荡培养至OD值为0.6-0.8，加入IPTG至终浓度lmmol/L，继续于37℃摇床培养3-4小时。培养液经10000rpm离心1分钟，弃上清，收集菌体，加入100μl的悬浮缓冲液，充分震荡悬浮后再加入100μl 2×上样缓冲液。煮沸10分钟后迅速置于冰上，冷却后。作为样品备用。
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好好做实验，毕业找份好工作！
9楼2013-09-24 08:43:20
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无花草

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by guoyanfei at 2013-09-24 08:39:06
你的先让菌体总蛋白跑出来，你的上样Buffer可能有问题；可能菌体内有完全裂解，所以连菌体蛋白都看不到。

我用的是6×Protein Loading Buffer。其实我有个问题没弄明白，Loading Buffer和上样buffer有没有区别？
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好好做实验，毕业找份好工作！
10楼2013-09-24 08:46:24
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