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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助RNA提取后 PCR为啥跑不出来
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兰羊羊

银虫 (初入文坛)

[求助] 求助RNA提取后 PCR为啥跑不出来

提取RNA 很好 小胶检测条带很清楚，为啥跑RT-PCR 用的引物是随机引物Radom. rapad-PCR用的随机锚定配对的，，为啥检测不出来条带啊，求大神指点啊
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1楼 2013-09-14 21:44:52
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

LRY111

新虫 (初入文坛)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-20 00:55:10
应该是你的RNA纯度较低，含有多酚类杂质以至于反转录酶失活了，建议测定一下260/230是否大于2.0
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3楼2013-09-19 19:48:43
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LRY111

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 兰羊羊 at 2013-09-22 08:29:14
我们实验室一般都是用的TRIZOL 提取法，老板现在在国外用的也是这种方法，他说可能是反转录试剂盒不行，建议换呢，之前我们用这种方法做的还不错，最近不知道咋回事，艾 做RNA的伤不起啊...

老板并不是什么都懂，我之前用的是Invivogen TRIZOL，但是出了问题，对于RNA提取我研究了半年，才终于搞清楚。如果你能够用TRIZOL提取出RNA，那么建议在沉淀时减少加入异丙醇的量，希望能够对你有所帮助。
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8楼2013-09-22 18:34:04
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普通回帖

bullfrog325

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
兰羊羊: 金币+1, ★有帮助, 如果用β-actin作为内参，你的反应体系和程序是什么呀？ 2013-09-14 22:18:16
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 。从根本去入手 2013-09-15 13:43:32
做一个看家基因试试, 要是还没有产物的话考虑是不是反转录做失败了
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2楼2013-09-14 21:50:32
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兰羊羊

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by LRY111 at 2013-09-19 19:48:43
应该是你的RNA纯度较低，含有多酚类杂质以至于反转录酶失活了，建议测定一下260/230是否大于2.0

不大于2，测的才是1点几
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4楼2013-09-21 08:47:19
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xv1215

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
兰羊羊: 金币+2, ★有帮助, 好的，谢谢哈 2013-09-22 08:24:51
先测一下260/280在1.8-2.0之间可用，上下浮动不大也可，然后就是内参基因一起来，再不出来就得检查PCR的参数了

[ 发自小木虫客户端 ]
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5楼2013-09-21 10:36:49
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LRY111

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 兰羊羊 at 2013-09-21 08:47:19
不大于2，测的才是1点几...

你的RNA中存在较高含量的多酚类物质，致使你的反转录酶失活，这是你进行PCR失败的主要原因。
建议方法：使用CTAB-LiCl法提取RNA，此种方法国外已经发了很多文章，你可以查一下。目前，植物RNA的提取要难于动物，原因在于植物细胞中有着过多的植物多酚，如苹果、棉花。你可以查一下相关资料。另外，你现在所提取的RNA如果真如前面我所讲的情况，基本已无法补救，多酚与糖、蛋白质、核酸紧密络合，是无法分开的。RNA在水中的溶解度为40微克/微升，具备较高的溶解能力。
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兰羊羊
6楼2013-09-21 10:42:39
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兰羊羊

银虫 (初入文坛)
送红花一朵
引用回帖:
6楼: Originally posted by LRY111 at 2013-09-21 10:42:39
你的RNA中存在较高含量的多酚类物质，致使你的反转录酶失活，这是你进行PCR失败的主要原因。
建议方法：使用CTAB-LiCl法提取RNA，此种方法国外已经发了很多文章，你可以查一下。目前，植物RNA的提取要难于动物，原 ...

我们实验室一般都是用的TRIZOL 提取法，老板现在在国外用的也是这种方法，他说可能是反转录试剂盒不行，建议换呢，之前我们用这种方法做的还不错，最近不知道咋回事，艾 做RNA的伤不起啊
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7楼2013-09-22 08:29:14
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兰羊羊

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by LRY111 at 2013-09-22 18:34:04
老板并不是什么都懂，我之前用的是Invivogen TRIZOL，但是出了问题，对于RNA提取我研究了半年，才终于搞清楚。如果你能够用TRIZOL提取出RNA，那么建议在沉淀时减少加入异丙醇的量，希望能够对你有所帮助。...

非常感谢，你们用的那个反转录试剂盒是什么牌子的？
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9楼2013-09-22 20:34:13
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兰羊羊

银虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by LRY111 at 2013-09-22 18:34:04
老板并不是什么都懂，我之前用的是Invivogen TRIZOL，但是出了问题，对于RNA提取我研究了半年，才终于搞清楚。如果你能够用TRIZOL提取出RNA，那么建议在沉淀时减少加入异丙醇的量，希望能够对你有所帮助。...

还有就是我们做的是动物组织的
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10楼2013-09-22 20:51:48
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