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[求助] western blot实验交流

western blot结果，目标条带时有时无，而内参一般都还比较好，转膜Marker也很清晰，不知道如何解释。（一抗过夜；二抗室温一小时；转膜80V，1h；封闭5%牛奶室温1h）

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1楼 2013-09-13 14:11:19

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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-13 22:24:06

楼主信息量太少！目标蛋白多大？你用的什么膜？湿转还是干转？？背景如何？是否有非特异性条带出现？最好把内参和目的的图像一起拿出来看看

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2楼2013-09-13 14:58:44

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3楼: Originally posted by zhangyoujian at 2013-09-14 08:57:25
样品是不是同一个样品？条带没有出现是我们会重洗洗膜后再按孵一抗和二抗

是同一个样品，怎么洗啊？TBST？

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4楼2013-09-14 09:39:07

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zhangyoujian

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样品是不是同一个样品？条带没有出现是我们会重洗洗膜后再按孵一抗和二抗

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3楼2013-09-14 08:57:25

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2楼: Originally posted by 八头小猪 at 2013-09-13 14:58:44
楼主信息量太少！目标蛋白多大？你用的什么膜？湿转还是干转？？背景如何？是否有非特异性条带出现？最好把内参和目的的图像一起拿出来看看

目标蛋白57kd左右，用PVDF膜，湿转，背景很干净，非特异性很少。

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5楼2013-09-14 09:43:23

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感觉可能是一抗没有包上。。。

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6楼2013-09-14 09:51:36

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还是上图吧，不然真没法分析，具体什么蛋白，表达量高低也得清楚

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7楼2013-09-14 14:47:41

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应该是抗体问题，抗体有没有过冻融？拿分装过没有冻融的抗体试下，或者可以加大一抗的浓度试试，内参能出来转膜应该没问题

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8楼2013-09-14 21:25:36

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6楼: Originally posted by 回头太难 at 2013-09-14 09:51:36
感觉可能是一抗没有包上。。。

但为什么时好时坏

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9楼2013-09-15 18:08:42

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8楼: Originally posted by guxinhan123 at 2013-09-14 21:25:36
应该是抗体问题，抗体有没有过冻融？拿分装过没有冻融的抗体试下，或者可以加大一抗的浓度试试，内参能出来转膜应该没问题

没有冻融过，一抗浓度已经很高了

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10楼2013-09-15 18:10:18

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