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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » over-lap PCR 定点突变
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bingdong05

银虫 (正式写手)

[求助] over-lap PCR 定点突变 已有1人参与

最近在做点突变，利用的是over-lap PCR法，有个问题请教各位虫友哈：前两次pcr产物回收后，第三轮pcr时该如何去做呢？退火温度如何设定呢？是1）先不加上下游引物，让前两次pcr产物混合后，互为模板进行pcr，几个循环后再加入引物（若这样的话，退火温度如何设定呢，几个循环后再加上下游引物，退火温度还需重新设定吗？），还是2）开始就将引物加进去，进行pcr（这样退火温度如何设定呢）？还望虫友们不吝赐教哈！
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1楼 2013-09-06 12:33:44
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ctajack

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

据 丁香通（网址：https://www.biomart.cn/experiment/457/741/43972.htm），“第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后在加入引物A1和B2以及 TAQ酶，这样做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦。另外一种方法是将引物，双模板，酶，dntp等所有的反应成分均一起加入PCR管，进行反应， 好处是节省时间，不太麻烦。”
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4楼2020-12-07 10:25:09
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clcl88

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 17:41:07
我是开始就加入引物进行pcr的，退火温度跟前两轮的差不多吧。。。主要是引物别弄错，退火温度p不出来再摸索
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2楼2013-09-06 14:17:59
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475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 17:41:14
gyesang: 回帖置顶 2013-09-06 17:41:16
直接将两次でPCR产物等物质的量混合，然后用第一个片段で上游引物和第二个片段で下游引物，按平时でPCR程序进行就行了，没什么问题で，只要你的两个PCR片段是等比で
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
3楼2013-09-06 14:34:01
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ctajack

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by ctajack at 2020-12-07 10:25:09
据 丁香通（网址：https://www.biomart.cn/experiment/457/741/43972.htm），“第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后在加入引物A1和B2以及 TA ...

补充一下，上贴所指丁香通网页上的"这就是我们在设计引物的时候在A2的5端加入了20个B基因5端的序列"全面的说是“20个B基因5'端反向互补序列”。
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5楼2020-12-07 11:16:46
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