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bingdong05银虫 (正式写手)
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over-lap PCR 定点突变 已有1人参与
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| 最近在做点突变，利用的是over-lap PCR法，有个问题请教各位虫友哈：前两次pcr产物回收后，第三轮pcr时该如何去做呢？退火温度如何设定呢？是1）先不加上下游引物，让前两次pcr产物混合后，互为模板进行pcr，几个循环后再加入引物（若这样的话，退火温度如何设定呢，几个循环后再加上下游引物，退火温度还需重新设定吗？），还是2）开始就将引物加进去，进行pcr（这样退火温度如何设定呢）？还望虫友们不吝赐教哈！ |
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clcl88
银虫 (小有名气)
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2楼2013-09-06 14:17:59
3楼2013-09-06 14:34:01
【答案】应助回帖
| 据 丁香通（网址：https://www.biomart.cn/experiment/457/741/43972.htm），“第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后在加入引物A1和B2以及 TAQ酶，这样做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦。另外一种方法是将引物，双模板，酶，dntp等所有的反应成分均一起加入PCR管，进行反应， 好处是节省时间，不太麻烦。” |
4楼2020-12-07 10:25:09
5楼2020-12-07 11:16:46
