应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » over-lap PCR 定点突变
51/1返回列表
查看: 2111  |  回复: 4
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

bingdong05

银虫 (正式写手)

[求助] over-lap PCR 定点突变 已有1人参与

最近在做点突变，利用的是over-lap PCR法，有个问题请教各位虫友哈：前两次pcr产物回收后，第三轮pcr时该如何去做呢？退火温度如何设定呢？是1）先不加上下游引物，让前两次pcr产物混合后，互为模板进行pcr，几个循环后再加入引物（若这样的话，退火温度如何设定呢，几个循环后再加上下游引物，退火温度还需重新设定吗？），还是2）开始就将引物加进去，进行pcr（这样退火温度如何设定呢）？还望虫友们不吝赐教哈！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-09-06 12:33:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

clcl88

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 17:41:07
我是开始就加入引物进行pcr的，退火温度跟前两轮的差不多吧。。。主要是引物别弄错，退火温度p不出来再摸索
赞一下 回复此楼
2楼2013-09-06 14:17:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流！ 2013-09-06 17:41:14
gyesang: 回帖置顶 2013-09-06 17:41:16
直接将两次でPCR产物等物质的量混合，然后用第一个片段で上游引物和第二个片段で下游引物，按平时でPCR程序进行就行了，没什么问题で，只要你的两个PCR片段是等比で
赞一下 回复此楼
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
3楼2013-09-06 14:34:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ctajack

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

据 丁香通（网址：https://www.biomart.cn/experiment/457/741/43972.htm），“第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后在加入引物A1和B2以及 TAQ酶，这样做的好处是可以得到特异的扩增，缺点是麻烦。另外一种方法是将引物，双模板，酶，dntp等所有的反应成分均一起加入PCR管，进行反应， 好处是节省时间，不太麻烦。”
赞一下 回复此楼
4楼2020-12-07 10:25:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ctajack

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by ctajack at 2020-12-07 10:25:09
据 丁香通（网址：https://www.biomart.cn/experiment/457/741/43972.htm），“第三步目前很多人的做法都不同，有的人是先加入模板A，B，dNTP，Buffer，水，然后进行3－5个循环的扩增，然后在加入引物A1和B2以及 TA ...

补充一下，上贴所指丁香通网页上的"这就是我们在设计引物的时候在A2的5端加入了20个B基因5端的序列"全面的说是“20个B基因5'端反向互补序列”。
赞一下 回复此楼
5楼2020-12-07 11:16:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 bingdong05 的主题更新
51/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考博] 澳大利亚 Murdoch University 全奖博士招生（3个名额）地质化工冶金领域 +32 AI8RaGaPaSCR 2026-08-07 34/1700 2026-08-13 22:15 by bPzCM0AzNM3W
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +10 医学老男孩 2026-08-13 27/1350 2026-08-13 21:43 by chemsynth
[基金申请] 小木虫上这么多卖论文的，真有人买论文么？感觉没必要啊 +9 Tide man 2026-08-10 10/500 2026-08-13 20:33 by 温淼淼淼
[文学芳草园] 阿姨 +4 汪汪锅 2026-08-09 4/200 2026-08-13 19:43 by arzu_hma
[硕博家园] 一作与独作在应聘高校教师时区别大吗 +3 mbygzh 2026-08-08 4/200 2026-08-13 19:31 by 龙-樱
[基金申请] FileCode能看出啥？ +10 要乐观耀哥 2026-08-10 28/1400 2026-08-13 17:51 by 医学老男孩
[基金申请] filecode +14 documentary 2026-08-10 16/800 2026-08-13 16:39 by 润生71
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] 不应该看fileCode +7 且听虎啸 2026-08-12 9/450 2026-08-13 14:27 by flydreamws
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +9 家与远方 2026-08-10 14/700 2026-08-13 09:41 by 臭臭不臭01
[基金申请] 应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键 +22 Lanmanbaby 2026-08-09 36/1800 2026-08-12 22:50 by sdfapple719
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[硕博家园] 读博的好处 +3 lnee 2026-08-11 3/150 2026-08-11 18:10 by 希望我好好的
[基金申请] 什么时候出结果，有咨询渠道？？？ +3 Tide man 2026-08-11 3/150 2026-08-11 17:54 by kudofaye
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 关于代码变化问题，想知道的进来 +17 且听虎啸 2026-08-07 24/1200 2026-08-10 18:35 by zhangduo2008
[基金申请] fileCode有新解读？ +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭