24小时热门版块排行榜    

查看: 2127  |  回复: 4

bingdong05

银虫 (正式写手)

[求助] over-lap PCR 定点突变 已有1人参与

最近在做点突变,利用的是over-lap PCR法,有个问题请教各位虫友哈:前两次pcr产物回收后,第三轮pcr时该如何去做呢?退火温度如何设定呢?是1)先不加上下游引物,让前两次pcr产物混合后,互为模板进行pcr,几个循环后再加入引物(若这样的话,退火温度如何设定呢,几个循环后再加上下游引物,退火温度还需重新设定吗?),还是2)开始就将引物加进去,进行pcr(这样退火温度如何设定呢)?还望虫友们不吝赐教哈!
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

clcl88

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流! 2013-09-06 17:41:07
我是开始就加入引物进行pcr的,退火温度跟前两轮的差不多吧。。。主要是引物别弄错,退火温度p不出来再摸索
2楼2013-09-06 14:17:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖交流! 2013-09-06 17:41:14
gyesang: 回帖置顶 2013-09-06 17:41:16
直接将两次でPCR产物等物质的量混合,然后用第一个片段で上游引物和第二个片段で下游引物,按平时でPCR程序进行就行了,没什么问题で,只要你的两个PCR片段是等比で
可以朝九晚五,也能浪迹天涯
3楼2013-09-06 14:34:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ctajack

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

据 丁香通(网址:https://www.biomart.cn/experiment/457/741/43972.htm),“第三步目前很多人的做法都不同,有的人是先加入模板A,B,dNTP,Buffer,水,然后进行3-5个循环的扩增,然后在加入引物A1和B2以及 TAQ酶,这样做的好处是可以得到特异的扩增,缺点是麻烦。另外一种方法是将引物,双模板,酶,dntp等所有的反应成分均一起加入PCR管,进行反应, 好处是节省时间,不太麻烦。”
4楼2020-12-07 10:25:09
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ctajack

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
4楼: Originally posted by ctajack at 2020-12-07 10:25:09
据 丁香通(网址:https://www.biomart.cn/experiment/457/741/43972.htm),“第三步目前很多人的做法都不同,有的人是先加入模板A,B,dNTP,Buffer,水,然后进行3-5个循环的扩增,然后在加入引物A1和B2以及 TA ...

补充一下,上贴所指丁香通网页上的"这就是我们在设计引物的时候在A2的5端加入了20个B基因5端的序列"全面的说是“20个B基因5'端反向互补序列”。
5楼2020-12-07 11:16:46
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 bingdong05 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 面上合作单位盖章 +6 ssyjh 2026-08-27 9/450 2026-09-01 20:01 by huagongfeihu
[基金申请] 学科评审组评审是指会评吗? +4 瞬息宇宙 2026-08-31 4/200 2026-09-01 14:58 by jiaoxg
[论文投稿] 小白求助 投论文要求的highlights应该如何写 5+3 l1963982152 2026-08-29 4/200 2026-09-01 09:04 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 麻烦专家们看看评委们的意见(F口面上) +7 gdd2018 2026-08-28 12/600 2026-09-01 08:32 by 尼古拉斯小虫
[基金申请] 怎么看青基中了没有啊 +6 叶九微 2026-08-26 6/300 2026-08-31 23:54 by yudaoqian88
[基金申请] 基金未中,这种答复是模板吗? +6 zhaosm1982 2026-08-27 7/350 2026-08-31 21:18 by qdxxmc
[基金申请] 能否申诉? +7 echo8914667 2026-08-30 8/400 2026-08-31 17:00 by yihongxu
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗? +7 349506619 2026-08-28 7/350 2026-08-31 13:39 by 冼亮淀粉酶
[基金申请] 基金不中,共勉 +12 eulota 2026-08-26 12/600 2026-08-31 08:42 by ZJTJZ
[基金申请] 有没有仍没收到信息的 +7 德尚中行 2026-08-27 8/400 2026-08-30 20:52 by purplejack
[基金申请] 国自然面上复盘~欢迎讨论 (金币+15) +15 晴天加油 2026-08-26 16/800 2026-08-29 18:28 by symmetry
[基金申请] 系统查不到 +11 董八千 2026-08-26 11/550 2026-08-28 18:06 by Leogzhya
[基金申请] 基金系统什么内容也没有 30+4 winsaint 2026-08-27 9/450 2026-08-28 11:06 by maolC
[基金申请] 怎么查啊 +6 huang1991js 2026-08-26 6/300 2026-08-28 08:42 by winsaint
[基金申请] 看板上这么多中的,有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 为什么 国际(地区)合作与交流项目 没有放榜? 10+3 majunge000 2026-08-26 11/550 2026-08-27 08:42 by 北京莱茵编辑
[基金申请] 我不理解! +15 Edward_pc 2026-08-26 23/1150 2026-08-26 20:34 by zzuzxg
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 牛来!米来!面来! +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
信息提示
请填处理意见