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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 离子交换蛋白纯化
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下雨了吗__

铁杆木虫 (小有名气)

[求助] 离子交换蛋白纯化

我做蛋白纯化，采用的是SP离子交换，采用线性洗脱，一般蛋白在洗脱液6-15%的时候出峰，但后来我配溶液用的pH计有些不准了，所以配的冲平缓冲液和洗脱液pH均有些不准，然后做AKTA，在上述区间出了极小的峰（取名峰1,2,3），洗脱液升到17%左右时（一般这种情况就不会再出目标峰了）我就将洗脱液调至100%，洗杂蛋白，结果出了很高的峰（峰4），而且电泳结果显示，峰1,2,3,4均含目标蛋白。问：a:为什么线性洗脱时目标峰总是出好几个峰呢，以前的也是，怎样才能让它变成一个峰呢，跟我的洗脱方式有关吗？b：峰4按以前是没有目标蛋白的，但这次含量很高，是我的缓冲液pH改变了，所以出峰的位置改变，可能大于17%了？还是我的柱子出了问题呢？请高手指教
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1楼 2013-08-24 12:49:59
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+3, 谢谢分析 2013-08-27 06:10:02
下雨了吗__: 金币+2 2013-08-28 08:48:03
1.你的目标蛋白的带电情况和分子量不一致，正常处于一个范围内，因此做线性洗脱时会有几个不一样的峰出来，尤其是当你的填料颗粒比较细小和均匀的时候。
2.这次你pH不对，其实你应该有目的的延长一下线性洗脱的梯度，既然知道问题所在，再进行一个实验验证一下就可以了。
3.柱子只要在正确的条件下出峰情况一致就没有坏，及时用清洗液清洗再生，保护好柱子。
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2楼2013-08-26 12:23:01
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wangchclove

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-08-27 06:09:52
a：杂蛋白的干扰，再就是分子间有没有二硫键 单体 多聚体之类的 加没加DTT；
b:很可能是Ph的关系，影响还是挺大的
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Good
3楼2013-08-26 20:24:24
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下雨了吗__

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by wangchclove at 2013-08-26 20:24:24
a：杂蛋白的干扰，再就是分子间有没有二硫键 单体 多聚体之类的 加没加DTT；
b:很可能是Ph的关系，影响还是挺大的

没有二硫键，有一个半胱氨酸。以前纯化的蛋白没有半胱氨酸的时候也会出现两个目标峰
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4楼2013-08-27 08:26:08
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下雨了吗__

铁杆木虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wolfman840 at 2013-08-26 12:23:01
1.你的目标蛋白的带电情况和分子量不一致，正常处于一个范围内，因此做线性洗脱时会有几个不一样的峰出来，尤其是当你的填料颗粒比较细小和均匀的时候。
2.这次你pH不对，其实你应该有目的的延长一下线性洗脱的梯度 ...

同一种蛋白怎么会带电情况不一样呢
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5楼2013-08-27 08:27:22
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yakir

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
下雨了吗__: 金币+2 2013-08-28 08:48:19
a. 蛋白表达后的修饰不一定一样的，举个例子，同一蛋白，部分可能被磷酸化，部分没有，表面电荷就会不一样的等等。。。同一蛋白在线性洗脱下出现几个峰是很正常的，尤其是线性时间长，填料分辨率高的情况下。尤其是做蛋白结晶的，更需要把不同修饰的同一蛋白分开，才能尽量保证蛋白的均一性，有利于晶体形成。
  希望出现同一峰的话，你直接30%洗脱，肯定就只有一个峰，或者换换分辨率比较低的柱子，再或者减少线性洗脱的时间，基本上都可以得到一个峰。
b. PH改变了一般会影响出峰时间的，所以PH计每次用前最好校准，如果你懒得校准，你可以直接测一下校准液看看PH是否有区别，如果有再校准，没有的话就可以使用了。
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一步一步！
6楼2013-08-27 10:00:58
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joux19

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
学习了，希望这个帖子可以多讨论
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7楼2013-08-27 10:22:37
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wolfman840

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
下雨了吗__: 金币+1 2013-08-28 08:48:28
引用回帖:
6楼: Originally posted by yakir at 2013-08-27 10:00:58
a. 蛋白表达后的修饰不一定一样的，举个例子，同一蛋白，部分可能被磷酸化，部分没有，表面电荷就会不一样的等等。。。同一蛋白在线性洗脱下出现几个峰是很正常的，尤其是线性时间长，填料分辨率高的情况下。尤其是 ...

解释的不错，另外补充一个，同一个目的蛋白，他也可能有聚体，片段等等的形式，也会造成出不同的峰，而且蛋白表达也是灵活的，可能少几个氨基酸，分子量差几个KD，那峰就差远了。
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8楼2013-08-27 10:23:55
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葡萄王子

铁虫 (初入文坛)
PH不准你可以矫正一下，很简单的
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9楼2014-10-13 10:38:19
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