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离子交换蛋白纯化
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| 我做蛋白纯化，采用的是SP离子交换，采用线性洗脱，一般蛋白在洗脱液6-15%的时候出峰，但后来我配溶液用的pH计有些不准了，所以配的冲平缓冲液和洗脱液pH均有些不准，然后做AKTA，在上述区间出了极小的峰（取名峰1,2,3），洗脱液升到17%左右时（一般这种情况就不会再出目标峰了）我就将洗脱液调至100%，洗杂蛋白，结果出了很高的峰（峰4），而且电泳结果显示，峰1,2,3,4均含目标蛋白。问：a:为什么线性洗脱时目标峰总是出好几个峰呢，以前的也是，怎样才能让它变成一个峰呢，跟我的洗脱方式有关吗？b：峰4按以前是没有目标蛋白的，但这次含量很高，是我的缓冲液pH改变了，所以出峰的位置改变，可能大于17%了？还是我的柱子出了问题呢？请高手指教 |
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a. 蛋白表达后的修饰不一定一样的，举个例子，同一蛋白，部分可能被磷酸化，部分没有，表面电荷就会不一样的等等。。。同一蛋白在线性洗脱下出现几个峰是很正常的，尤其是线性时间长，填料分辨率高的情况下。尤其是做蛋白结晶的，更需要把不同修饰的同一蛋白分开，才能尽量保证蛋白的均一性，有利于晶体形成。 希望出现同一峰的话，你直接30%洗脱，肯定就只有一个峰，或者换换分辨率比较低的柱子，再或者减少线性洗脱的时间，基本上都可以得到一个峰。 b. PH改变了一般会影响出峰时间的，所以PH计每次用前最好校准，如果你懒得校准，你可以直接测一下校准液看看PH是否有区别，如果有再校准，没有的话就可以使用了。 |
6楼2013-08-27 10:00:58
joux19
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