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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 最近实验室T载体连接一直都假阳性
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kamiles_007

新虫 (初入文坛)

[交流] 最近实验室T载体连接一直都假阳性

最近一个月来，实验室几个同学包括我在内，所有做分子的都是T载体连接总是得不到自己想要的阳性克隆，菌液PCR的电泳图显示，连接上的片段总是比我的目的片段要短，不知道是什么原因！
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1楼 2013-08-22 00:00:52
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Da果冻

铜虫 (初入文坛)
★ ★ ★
kamiles_007(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-30 22:25:36
我们实验室以前也是碰到这样的问题，连接之前目的片段需要切胶回收，你得保证胶回收试剂盒的质量，有较高的浓度连接T载体阳性克隆才会多，而且摩尔比例要控制在目的片段:T载体=1:4左右，你再试试吧
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5楼2013-08-23 01:37:23
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yujitianqing

铁虫 (正式写手)
★
kamiles_007(金币+1): 谢谢参与
连接前胶回收过吗？确保是纯的DNA？
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2楼2013-08-22 08:51:55
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charrymiao

新虫 (初入文坛)
★ ★ ★
kamiles_007(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-08-22 17:15:11
首先，你先测一下你核酸胶回收的浓度，看浓度怎么样，说不定胶回收操作有问题。然后，看看你的连接条件是不是有什么问题。电泳跑的短我也发生过，但是最后测序没什么问题，最后大家说那染料有问题。你下次多跑会儿，把胶的浓度稍微降低看看。希望能帮到你！
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3楼2013-08-22 11:26:50
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33ggdf

新虫 (小有名气)
★ ★ ★
kamiles_007(金币+1): 谢谢参与
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-09-30 22:25:52
gyesang: 回帖置顶 2013-09-30 22:25:54
1 建议提高目的片段的浓度或把减少buffer的用量加给目的片段（buffer的量是可以做小的调整的 譬如减少0.5微升，目的片段加大0.5微升）
2 如果目的片段较大阴性的是很多 把单菌落都挑了吧 有一次我的目的片段是1100bp 我挑了50个才有两个阳性的
3 做两个连接体系 涂两个皿 加大成功概率
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6楼2013-08-23 19:37:42
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