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huguangdong

至尊木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

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~小绿~: 金币+1, ★★★很有帮助 2013-08-13 13:14:19
小丹木木: 金币+4, MolEPI+1, 很好的经验啊 2013-08-13 17:12:01
以我本人的经验,如果你这段基因是用来做后续实验的不仅仅是检测的话,应该这样来做
1 用酶和buffer分离的体系来做,不要用混合液,尽管现如今的产品也没什么问题,但是考虑到你基因的重要性,用TAKARA的primer star酶来扩增。
2 扩增体系放大,用50ul较好,实践证明,50ul体系的PCR扩增出目的条带的概率较高(纯属本人经验)。
3 从你的PCR条件来看,建议使用传统PCR体系,即变性温度为95度,退火温度请用梯度的方式摸索一下,延伸时间跟改为1min,你的延伸时间太短,我也用过primer star这个酶,作为一个高保真酶,他的扩增效率并没有说明书上宣传的那么高,一般来说普通TAQ酶1000bp/min,高保真酶500bp/min,现在有很多改进版,其实都不保险,咱也不是为了那点时间,所以延伸射程1min为好。最后的延伸时间改为5min为好。
4 另外基因组提取质量是否符合PCR要求,最好测一下浓度,PCR模板不宜太多也不宜太少,控制在100ng最好。
5 如果这样还没有结果,请分析引物,是否是引物问题。
14楼2013-08-13 12:30:44
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