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基因组一直P不出目的基因，跪求分析
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菌是从德国DSM买的，菌体提基因组后核酸电泳图如下： 之后进行基因组PCR PCR体系为： 8.2ul ddH2O,0.6ul F, 0.6ul R, 0.6ul 基因组DNA，10ul Prime Star DNA聚合酶混悬液 PCR条件试过退火温度梯度： 98度，2min 98度,30s 56-56度，20s 72度，5s(该酶是5s/kb) 循环30次 72度，2min 4度  只有非特异性条带，我的目的基因是750bp左右的。愁死了，求大牛开解呀 |
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 核酸生物学实验经验 | 【分子生物】EPI帖 |
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20083630zhan
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gyesang: 回帖置顶 2013-08-13 09:12:37
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72度，5s(该酶是5s/kb) 你确定没有看错这种聚合酶的扩增效率？ （1）5s扩增1kb，这也太快了吧，如果是你说的扩增效率的话，你扩增的片段长度大约是4kb，你的基因这么长，应该选择适合于扩增长片段的酶， （2）如果你的模板是基因组DNA ，那么你在预变性的时候应该适当地延长时间，2min有点短了， （3）你扩增你的目的基因的时候，你选择的Marker增么比你的目的基因分子量还小啊，这说明你的Marker选择的不合适，或者是那几条带不是你的目的条带 （4）Marker没有跑开，你的胶的浓度大了 |
5楼2013-08-12 22:34:43
huguangdong
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小丹木木: 金币+4, MolEPI+1, 很好的经验啊 2013-08-13 17:12:01
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小丹木木: 金币+4, MolEPI+1, 很好的经验啊 2013-08-13 17:12:01
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以我本人的经验，如果你这段基因是用来做后续实验的不仅仅是检测的话，应该这样来做 1 用酶和buffer分离的体系来做，不要用混合液，尽管现如今的产品也没什么问题，但是考虑到你基因的重要性，用TAKARA的primer star酶来扩增。 2 扩增体系放大，用50ul较好，实践证明，50ul体系的PCR扩增出目的条带的概率较高（纯属本人经验）。 3 从你的PCR条件来看，建议使用传统PCR体系，即变性温度为95度，退火温度请用梯度的方式摸索一下，延伸时间跟改为1min，你的延伸时间太短，我也用过primer star这个酶，作为一个高保真酶，他的扩增效率并没有说明书上宣传的那么高，一般来说普通TAQ酶1000bp/min,高保真酶500bp/min,现在有很多改进版，其实都不保险，咱也不是为了那点时间，所以延伸射程1min为好。最后的延伸时间改为5min为好。 4 另外基因组提取质量是否符合PCR要求，最好测一下浓度，PCR模板不宜太多也不宜太少，控制在100ng最好。 5 如果这样还没有结果，请分析引物，是否是引物问题。 |
14楼2013-08-13 12:30:44
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2013-08-17 12:25:48, 31.25 K
31楼2013-08-17 12:24:08
yb19841014
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yb19841014
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