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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物退火温度怎么确定？
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yxliu

金虫 (小有名气)

[求助] 引物退火温度怎么确定？

我的上游引物Tm（50mmna+）67.5，GC%73.3，下游引物Tm56.5，GC%46.7.PCR退火温度设置50-64，电泳都没有跑出条带，但用别人的引物能够跑出。退火温度设置不合适还是需要重新设引物。新手求教。谢谢。
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1楼 2013-07-24 12:37:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yxliu: 金币+1, ★有帮助 2013-07-24 14:59:40
yxliu: 金币+1 2013-07-24 21:35:38
PCR目的片段多大，模板是什么，把具体体系和程序写下来。
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2楼2013-07-24 12:59:34
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-24 13:12:56
yxliu: 金币+1, 要做的方向不一样。。。。 2013-07-24 14:59:09
别人的引物能跑出来，那就说明 你的引物不是特别好。
另外还想对楼主说一句，不要总是纠结自己一定做好每一步，如果别人的能用就用别人，毕竟实验最终的目的才是最重要的。
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3楼2013-07-24 13:06:50
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yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-24 12:59:34
PCR目的片段多大，模板是什么，把具体体系和程序写下来。

目的片段1300多，模板cDNA。用的20ul的体系，引物各1，模板2,2xTaq 10，水补足。程序94度预变性5min.变性30s退火梯度50-64.30s，延伸72度90s。32个循环。最后72度10min。我想提高退火温度再试试。
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4楼2013-07-24 14:56:16
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hyphen007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yxliu: 金币+1 2013-07-24 21:35:16
上游和下游引物相差有些悬殊，导致退火温度不一致，这个应该是主要原因
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5楼2013-07-24 16:27:47
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nanamaka

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yxliu(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-07-24 23:16:29
设置一个touchdown程序试一下，如果实在没有条带，考虑重新设计引物吧
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人生若只如初见
6楼2013-07-24 22:26:54
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yxliu at 2013-07-24 14:56:16
目的片段1300多，模板cDNA。用的20ul的体系，引物各1，模板2,2xTaq 10，水补足。程序94度预变性5min.变性30s退火梯度50-64.30s，延伸72度90s。32个循环。最后72度10min。我想提高退火温度再试试。...

你是说用你的模板，别人的引物P其它基因可以P出来？cDNA为模板P时模板量本身会与你的目的基因的表达量有关，与其它基因很难比的。
PS：两个引物退火温度不一致时以Tm低的为准考虑PCR条件。
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7楼2013-07-24 23:23:54
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yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-24 23:23:54
你是说用你的模板，别人的引物P其它基因可以P出来？cDNA为模板P时模板量本身会与你的目的基因的表达量有关，与其它基因很难比的。
PS：两个引物退火温度不一致时以Tm低的为准考虑PCR条件。...

恩，用其他人的引物可以P出，目的基因是不一样。我昨天也想表达量了，但是原来的师兄做的时候P出来过，我只是换了个酶切位点。谢谢啦！
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8楼2013-07-25 08:33:15
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yxliu at 2013-07-25 08:33:15
恩，用其他人的引物可以P出，目的基因是不一样。我昨天也想表达量了，但是原来的师兄做的时候P出来过，我只是换了个酶切位点。谢谢啦！...

如果以前克隆过这个基因，你可以直接从克隆载体上P。此外，如果设计了酶切位点的引物计算退火温度时要把酶切位点和保护碱基去掉。
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9楼2013-07-25 09:33:56
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caozheng89

铁虫 (初入文坛)
引物重设
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10楼2013-07-25 10:25:11
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