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wei_suzhen

新虫 (小有名气)

[求助] 怎样确定合适的Tm值？

下面是我的引物的一些数据，根据这些数据怎么设计合适的退火温度？如果利用温度梯度来寻找合适的退火温度，大约从哪个范围设计温度，梯度是多少？每个梯度需要设计几个重复样品?

引物设计.png
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wei_suzhen

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1楼 2012-10-14 13:08:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-10-14 21:11:24
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2楼2012-10-14 15:15:20
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古屋子

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做梯度最好每隔温度梯度做两个重复，另外还得做空白对照
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3楼2012-10-14 16:34:48
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ilyzp

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-15 13:48:53
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4楼2012-10-14 17:09:02
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wei_suzhen

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ilyzp at 2012-10-14 17:09:02
其实软件上已经给出了Tm值了，但是如果要做PCR还要看你在哪个公司合成引物，像是三博和华大，一般的Tm值都会比软件设计的还要高，你就用Tm-5去做就行，如果是英俊合成，一般Tm都比较低，会比软件设计的低很多，但是 ...

是生工生物工程（上海）公司合成的。不过引物还没送回来，现在设计一些实验方案。确定一下最适的退火温度
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5楼2012-10-14 19:33:22
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wei_suzhen

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 古屋子 at 2012-10-14 16:34:48
做梯度最好每隔温度梯度做两个重复，另外还得做空白对照

你好，想问下怎么做空白对照
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6楼2012-10-14 19:34:13
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wei_suzhen

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2012-10-14 15:15:20
软件不是给出了Tm值了么？两条引物分别是64.5和63.7°C。虽然各种软件计算的Tm的结果有些不一样，你PCR的退火温度可以用Tm-5°C。其实PCR的引物在很大一个范围内都是工作的，只是扩增效率和特异性会有一定差别。如果 ...

你好，如果做温度梯度，一般相邻每个温度相差多少
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7楼2012-10-14 19:36:17
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
7楼: Originally posted by wei_suzhen at 2012-10-14 19:36:17
你好，如果做温度梯度，一般相邻每个温度相差多少...

PCR仪上有梯度功能，一般是A-H自上而下8排的温度从高到低。你只需选好温度范围，例如55-65度什么的，仪器会自动设置一个线性梯度平均分配在这8排样品中。
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8楼2012-10-15 01:11:07
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水寒冰006

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-10-15 13:49:07
不知道你用的是哪家的PCR仪，一般PCR仪有一个gradient的设置，可以采用touch down PCR，即在一个样品里面做退火温度的梯度，在合适的温度，扩增产物的数量会呈现出优势，从而大量扩增，比你去做梯度要容易很多。
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9楼2012-10-15 10:39:00
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zhangby2002

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
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小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-15 13:49:20
给你建议条件允许的话，你可以对合成几对。看你上面的PRIMER软件引物合成条件来看，不够严谨，TM值上下部超过5，GC含量同样，下面的发卡结构，引物二聚体等指标全部为NO.一般用PCR在模版P时，退货温度按引物合成单上为参考，做梯度，一般6个梯度，做个阴性阳性对照，六个梯度一般2°，结果应该可以的，通过跑胶你会摸到合适的退货温度的。祝成功。
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业精于勤，荒于嬉；行成于思，毁于随。
10楼2012-10-15 11:14:47
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