【答案】应助回帖

21楼2013-07-25 15:13:17

yxliu

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17楼: Originally posted by yilunanxia at 2013-07-25 14:53:28
我觉得你的引物得重新设计了，上游引物和下游引物的Tm值相差这么大真的很难P出条带

恩。

22楼2013-07-25 15:14:23

yxliu

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13楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-25 11:57:13
引物合成单上的是全部碱基都考虑进去的退火温度，你设计的酶切位点与保护碱基与模板并不配对，所以PCR起始时用引物合成单上考虑的温度不行。而且，cDNA模板中含有较多的RNA，会竞争引物。你使用的退火温度已经比较 ...

设计的酶切位点与保护碱基与模板并不配对？这个怎么判断。

23楼2013-07-25 15:57:33

cicelyzh

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【答案】应助回帖

引用回帖:

23楼: Originally posted by yxliu at 2013-07-25 15:57:33
设计的酶切位点与保护碱基与模板并不配对？这个怎么判断。...

你设计的引物上的酶切位点的碱基序列在cDNA上没有吧，这就是不与模板匹配了。当然，如果反应进行了若干循环后，P出来的序列里带有你设计的酶切位点序列，以这些DNA为模板时与引物完全匹配，所以，开始反应时的退火温度太高不行，当反应进行了若干循环后，P出的新序列比原cDNA模板量大很多时，退火温度可以提高。

24楼2013-07-26 00:42:37

wxl.1989822

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【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1

试一下touchdown吧 cDNA不太好P td效果会好些

25楼2013-07-26 08:51:32

yxliu

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24楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 00:42:37
你设计的引物上的酶切位点的碱基序列在cDNA上没有吧，这就是不与模板匹配了。当然，如果反应进行了若干循环后，P出来的序列里带有你设计的酶切位点序列，以这些DNA为模板时与引物完全匹配，所以，开始反应时的退火 ...

昨天翻冰箱终于找到了师兄留下的菌液，今天P了一下，可以。

多谢建议了。

26楼2013-07-26 14:37:35

yxliu

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25楼: Originally posted by wxl.1989822 at 2013-07-26 08:51:32
试一下touchdown吧 cDNA不太好P td效果会好些

谢谢建议。

27楼2013-07-26 14:37:51