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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物退火温度怎么确定？
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yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
16楼: Originally posted by 幽魂银龙 at 2013-07-25 13:19:57
没有dNTP...

用的蓝酶。Master Mix里面带缓冲液和dNTP
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21楼2013-07-25 15:13:17
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yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by yilunanxia at 2013-07-25 14:53:28
我觉得你的引物得重新设计了，上游引物和下游引物的Tm值相差这么大真的很难P出条带

恩。
22楼2013-07-25 15:14:23
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yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-25 11:57:13
引物合成单上的是全部碱基都考虑进去的退火温度，你设计的酶切位点与保护碱基与模板并不配对，所以PCR起始时用引物合成单上考虑的温度不行。而且，cDNA模板中含有较多的RNA，会竞争引物。你使用的退火温度已经比较 ...

设计的酶切位点与保护碱基与模板并不配对？这个怎么判断。
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23楼2013-07-25 15:57:33
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

引用回帖:
23楼: Originally posted by yxliu at 2013-07-25 15:57:33
设计的酶切位点与保护碱基与模板并不配对？这个怎么判断。...

你设计的引物上的酶切位点的碱基序列在cDNA上没有吧，这就是不与模板匹配了。当然，如果反应进行了若干循环后，P出来的序列里带有你设计的酶切位点序列，以这些DNA为模板时与引物完全匹配，所以，开始反应时的退火温度太高不行，当反应进行了若干循环后，P出的新序列比原cDNA模板量大很多时，退火温度可以提高。
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24楼2013-07-26 00:42:37
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wxl.1989822

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
试一下touchdown吧 cDNA不太好P td效果会好些
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25楼2013-07-26 08:51:32
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yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
24楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-26 00:42:37
你设计的引物上的酶切位点的碱基序列在cDNA上没有吧，这就是不与模板匹配了。当然，如果反应进行了若干循环后，P出来的序列里带有你设计的酶切位点序列，以这些DNA为模板时与引物完全匹配，所以，开始反应时的退火 ...

昨天翻冰箱终于找到了师兄留下的菌液，今天P了一下，可以。多谢建议了。
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26楼2013-07-26 14:37:35
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yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
25楼: Originally posted by wxl.1989822 at 2013-07-26 08:51:32
试一下touchdown吧 cDNA不太好P td效果会好些

谢谢建议。
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27楼2013-07-26 14:37:51
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