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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物退火温度怎么确定？
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yxliu

金虫 (小有名气)

[求助] 引物退火温度怎么确定？

我的上游引物Tm（50mmna+）67.5，GC%73.3，下游引物Tm56.5，GC%46.7.PCR退火温度设置50-64，电泳都没有跑出条带，但用别人的引物能够跑出。退火温度设置不合适还是需要重新设引物。新手求教。谢谢。
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1楼 2013-07-24 12:37:10
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
yxliu: 金币+2 2013-07-25 15:10:36
引用回帖:
11楼: Originally posted by yxliu at 2013-07-25 10:27:28
现在没有克隆载体了，只有cDNA,师兄毕业都弄没了。退火温度是按引物合成单上，昨天做了个47-67的梯度，还是不行。我换rTaq试试。...

引物合成单上的是全部碱基都考虑进去的退火温度，你设计的酶切位点与保护碱基与模板并不配对，所以PCR起始时用引物合成单上考虑的温度不行。而且，cDNA模板中含有较多的RNA，会竞争引物。你使用的退火温度已经比较低了，可以适当提高反应体系的镁离子浓度。
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13楼2013-07-25 11:57:13
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yxliu: 金币+1, ★有帮助 2013-07-24 14:59:40
yxliu: 金币+1 2013-07-24 21:35:38
PCR目的片段多大，模板是什么，把具体体系和程序写下来。
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2楼2013-07-24 12:59:34
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liyongliangx

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+1, 鼓励交流 2013-07-24 13:12:56
yxliu: 金币+1, 要做的方向不一样。。。。 2013-07-24 14:59:09
别人的引物能跑出来，那就说明 你的引物不是特别好。
另外还想对楼主说一句，不要总是纠结自己一定做好每一步，如果别人的能用就用别人，毕竟实验最终的目的才是最重要的。
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3楼2013-07-24 13:06:50
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yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-24 12:59:34
PCR目的片段多大，模板是什么，把具体体系和程序写下来。

目的片段1300多，模板cDNA。用的20ul的体系，引物各1，模板2,2xTaq 10，水补足。程序94度预变性5min.变性30s退火梯度50-64.30s，延伸72度90s。32个循环。最后72度10min。我想提高退火温度再试试。
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4楼2013-07-24 14:56:16
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