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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物退火温度怎么确定？
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yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-25 09:33:56
如果以前克隆过这个基因，你可以直接从克隆载体上P。此外，如果设计了酶切位点的引物计算退火温度时要把酶切位点和保护碱基去掉。...

现在没有克隆载体了，只有cDNA,师兄毕业都弄没了。退火温度是按引物合成单上，昨天做了个47-67的梯度，还是不行。我换rTaq试试。
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11楼2013-07-25 10:27:28
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yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by caozheng89 at 2013-07-25 10:25:11
引物重设

恩，不行只有重设了。
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12楼2013-07-25 10:31:07
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
yxliu: 金币+2 2013-07-25 15:10:36
引用回帖:
11楼: Originally posted by yxliu at 2013-07-25 10:27:28
现在没有克隆载体了，只有cDNA,师兄毕业都弄没了。退火温度是按引物合成单上，昨天做了个47-67的梯度，还是不行。我换rTaq试试。...

引物合成单上的是全部碱基都考虑进去的退火温度，你设计的酶切位点与保护碱基与模板并不配对，所以PCR起始时用引物合成单上考虑的温度不行。而且，cDNA模板中含有较多的RNA，会竞争引物。你使用的退火温度已经比较低了，可以适当提高反应体系的镁离子浓度。
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13楼2013-07-25 11:57:13
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xl0071334

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉你的上下游引物的GC含量差别太大
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14楼2013-07-25 12:54:48
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hj890509

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yxliu: 金币+1 2013-07-25 16:04:21
上下游引物Tm值相差太大，应该相差不超过5℃，重新设计引物吧
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15楼2013-07-25 13:18:47
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幽魂银龙

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yxliu at 2013-07-24 14:56:16
目的片段1300多，模板cDNA。用的20ul的体系，引物各1，模板2,2xTaq 10，水补足。程序94度预变性5min.变性30s退火梯度50-64.30s，延伸72度90s。32个循环。最后72度10min。我想提高退火温度再试试。...

没有dNTP
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16楼2013-07-25 13:19:57
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yilunanxia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得你的引物得重新设计了，上游引物和下游引物的Tm值相差这么大真的很难P出条带
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17楼2013-07-25 14:53:28
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yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by caozheng89 at 2013-07-25 10:25:11
引物重设

不行只能这样了。刚开始做就不顺。。。。
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18楼2013-07-25 15:09:13
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yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by xl0071334 at 2013-07-25 12:54:48
感觉你的上下游引物的GC含量差别太大

恩，原来师兄P出来过，我只是换了个酶切位点。
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19楼2013-07-25 15:11:36
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yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by hj890509 at 2013-07-25 13:18:47
上下游引物Tm值相差太大，应该相差不超过5℃，重新设计引物吧

20楼2013-07-25 15:11:57
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