应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 引物退火温度怎么确定？
272/3返回列表上一页123下一页
查看: 8081  |  回复: 26
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-25 09:33:56
如果以前克隆过这个基因，你可以直接从克隆载体上P。此外，如果设计了酶切位点的引物计算退火温度时要把酶切位点和保护碱基去掉。...

现在没有克隆载体了，只有cDNA,师兄毕业都弄没了。退火温度是按引物合成单上，昨天做了个47-67的梯度，还是不行。我换rTaq试试。
赞一下 回复此楼
11楼2013-07-25 10:27:28
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by caozheng89 at 2013-07-25 10:25:11
引物重设

恩，不行只有重设了。
赞一下 回复此楼
12楼2013-07-25 10:31:07
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
yxliu: 金币+2 2013-07-25 15:10:36
引用回帖:
11楼: Originally posted by yxliu at 2013-07-25 10:27:28
现在没有克隆载体了，只有cDNA,师兄毕业都弄没了。退火温度是按引物合成单上，昨天做了个47-67的梯度，还是不行。我换rTaq试试。...

引物合成单上的是全部碱基都考虑进去的退火温度，你设计的酶切位点与保护碱基与模板并不配对，所以PCR起始时用引物合成单上考虑的温度不行。而且，cDNA模板中含有较多的RNA，会竞争引物。你使用的退火温度已经比较低了，可以适当提高反应体系的镁离子浓度。
赞一下 回复此楼
13楼2013-07-25 11:57:13
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xl0071334

至尊木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
感觉你的上下游引物的GC含量差别太大
赞一下 回复此楼
14楼2013-07-25 12:54:48
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hj890509

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yxliu: 金币+1 2013-07-25 16:04:21
上下游引物Tm值相差太大，应该相差不超过5℃，重新设计引物吧
赞一下 回复此楼
15楼2013-07-25 13:18:47
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

幽魂银龙

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by yxliu at 2013-07-24 14:56:16
目的片段1300多，模板cDNA。用的20ul的体系，引物各1，模板2,2xTaq 10，水补足。程序94度预变性5min.变性30s退火梯度50-64.30s，延伸72度90s。32个循环。最后72度10min。我想提高退火温度再试试。...

没有dNTP
回复此楼
16楼2013-07-25 13:19:57
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yilunanxia

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我觉得你的引物得重新设计了，上游引物和下游引物的Tm值相差这么大真的很难P出条带
赞一下 回复此楼
17楼2013-07-25 14:53:28
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by caozheng89 at 2013-07-25 10:25:11
引物重设

不行只能这样了。刚开始做就不顺。。。。
赞一下 回复此楼
18楼2013-07-25 15:09:13
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by xl0071334 at 2013-07-25 12:54:48
感觉你的上下游引物的GC含量差别太大

恩，原来师兄P出来过，我只是换了个酶切位点。
赞一下 回复此楼
19楼2013-07-25 15:11:36
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yxliu

金虫 (小有名气)
引用回帖:
15楼: Originally posted by hj890509 at 2013-07-25 13:18:47
上下游引物Tm值相差太大，应该相差不超过5℃，重新设计引物吧

20楼2013-07-25 15:11:57
已阅   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yxliu 的主题更新
272/3返回列表上一页123下一页
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 听说今天filecode变了 +19 布布和一二 2026-08-06 33/1650 2026-08-07 01:25 by 云上清扬
[基金申请] 基金中了 +6 laoda193707 2026-08-06 6/300 2026-08-06 23:34 by dragonxp
[基金申请] filecode +10 等待解的谜 2026-08-06 14/700 2026-08-06 21:16 by zhanghaozhu
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +3 archvillain 2026-08-06 7/350 2026-08-06 21:05 by archvillain
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 6/300 2026-08-06 20:19 by 苏知砚
[有机交流] 一个有机合成实验室都需要哪些设备？ 50+3 kf2781974 2026-07-31 12/600 2026-08-06 15:11 by eddyin
[基金申请] 求各位大神看下 100+6 hpkpkpkp 2026-08-05 33/1650 2026-08-06 14:49 by zhiyanjiang
[教师之家] 咨询面上基金 +4 李长云 2026-07-31 7/350 2026-08-06 11:20 by 李长云
[基金申请] 影响面上的因素 +8 布布和一二 2026-08-05 11/550 2026-08-06 10:41 by 宝贝虫子
[基金申请] 8月时间戳变的，举个手。玩一下，释放压力 +9 archvillain 2026-08-04 11/550 2026-08-05 20:06 by wlwhappy
[基金申请] 面上再次挂了，太难了，躺也躺不了，倦也卷不过，小学校之殇！ +22 低垂的野花 2026-07-31 30/1500 2026-08-05 18:03 by 低垂的野花
[基金申请] 好消息？这个有何含义？？？ +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
[考博] 【2027博士申请】纳米药物递送方向 20+3 13586093586 2026-08-03 4/200 2026-08-05 09:59 by lfy8008
[基金申请] 有没有H口的？有收到消息的吗？ +3 超级海虾 2026-08-04 3/150 2026-08-04 17:26 by 学教育滴
[论文投稿] 十年后又回来了，论文投稿求助 +3 哈哈114477 2026-08-01 3/150 2026-08-04 15:40 by tegsgjy20
[基金申请] 纯娱乐，不喜欢勿喷 +7 Tide man 2026-08-04 10/500 2026-08-04 15:10 by loufangrui
[基金申请] 面上提前没消息，有中的吗 +14 archvillain 2026-08-02 18/900 2026-08-04 14:42 by archvillain
[基金申请] 娱乐 +4 Tide man 2026-08-03 4/200 2026-08-04 11:51 by wgch518
[基金申请] 什么时候能放榜呀？ +3 Jacob678 2026-08-03 3/150 2026-08-03 16:14 by gltch
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭