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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 动植物 » 综合其他 » 半定量PCR的一个问题
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lp_0820

木虫 (著名写手)

[求助] 半定量PCR的一个问题

做半定量PCR的时候，一般情况下是在反转录的时候将RNA的浓度调为一致，对不对？那么反转录后的cDNA浓度是不是会出现差异呢？我最近的实验就是反转录后cDNA的浓度差异有点大，最高的到了890微克，最低的才到790微克。那么我做PCR的时候能不能通过来调整cDNA的浓度来观察基因之间的表达差异呢？
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1楼 2013-07-20 08:21:16
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starseacow

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我认为不可以调整cDNA浓度，楼主所看到的cDNA浓度差异，其来源很可能就是由于样品RNA中不同RNA转录水平不同。
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植物生理群69993869，为避免广告，申请加入请提供木虫昵称，院校及专业信息
2楼2013-07-20 15:34:00
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做定量PCR的时候一般是只定量RNA的，反转录成cDNA不能直接定量，因为有RNA干扰，需要把RNA模板消化掉才能用nanodrop定量。而消化掉RNA模板对定量实验来说是非必须的，没有人去做。
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3楼2013-07-20 15:34:19
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lp_0820

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-20 15:34:19
做定量PCR的时候一般是只定量RNA的，反转录成cDNA不能直接定量，因为有RNA干扰，需要把RNA模板消化掉才能用nanodrop定量。而消化掉RNA模板对定量实验来说是非必须的，没有人去做。

那由于不同样品存在的反转录效率的差异如何消除？
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4楼2013-07-20 21:16:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
lp_0820: 金币+5 2013-07-21 08:56:48
引用回帖:
4楼: Originally posted by lp_0820 at 2013-07-20 21:16:01
那由于不同样品存在的反转录效率的差异如何消除？...

需要比较的样品要在同一批做反转录，并做master mix，否则反转录效率不同。上面我忘了提醒，反转录时加的dNTP在紫外也有吸收，会影响核酸定量。
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5楼2013-07-20 22:38:04
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