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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 【求助/交流】急！半定量PCR结果太不稳定
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friend.11

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助/交流】急！半定量PCR结果太不稳定

我做半定量PCR相看基因表达量的变化趋势，上调、下调或者不变。做半定量PCR做了很久，每一个基因都重复做了好几次，可是结果相当的不稳定，一个基因有时候上调，有时候下调。我都不知道该怎么分析结果。烦哪！！！有没有做过半定量的朋友提供一点经验，帮帮忙啊！
先谢过了！由于之前散尽了金币，现在金币较少，我会逐渐加上去的！请大家帮帮忙！

[ Last edited by friend.11 on 2011-3-31 at 19:57 ]
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kinda_

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1楼 2011-03-30 20:52:40
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咸鱼

金虫 (小有名气)
★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 感谢分享经验~ 2011-03-30 22:50:13
friend.11(金币+2): 你说的是定量！不过还是谢谢你！ 2011-03-31 19:46:44
我做过Real-time，我的基因每次做都挺稳定，你每次加样，操作都没问题吗？不过我们一个师兄芯片数据，我看有好多基因，三组数据之间结果也不稳定，有的上调，有的下调。我自己觉得这样的话，如果上调下调变化不大，是不是可以说基本上是对你所说的那个因素是不敏感的。它的不稳定只是因为环境或其他因素影响。至少跟那个因素之间没有直接关系，或者有也不是在基因水平，而是蛋白水平了吧。
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2楼2011-03-30 21:07:43
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65900931

银虫 (小有名气)
friend.11(金币+2): 谢谢！ 2011-03-31 19:55:28
做real time，重复三次，每次pcr做triplicate。主要看增加倍数和sd，用统计学方法分析差异的显著性。
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3楼2011-03-30 21:17:49
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hwlightning

铜虫 (初入文坛)
friend.11(金币+1): 2011-04-03 16:48:03
做定量PCR
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4楼2011-04-03 13:50:49
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rb

木虫 (著名写手)
friend.11(金币+1): 2011-04-03 16:48:24
现在半定量已经很少采用了。如果做半定量，那么起始浓度的标化非常重要。使用的PCR仪要固定，mix要同一批。还是建议用实时定量PCR不会比半定量贵多少，结果还更可靠。
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5楼2011-04-03 16:04:52
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dreaming0816

金虫 (著名写手)
friend.11(金币+1): 2011-04-04 14:57:19
半定量要把目的片段与内参放在一个管内做PCR和电泳的。
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6楼2011-04-03 16:58:59
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dreaming0816

金虫 (著名写手)
friend.11(金币+2): 2011-04-04 14:56:58
半定量的工作量其实比定量的工作量还要大，建议做定量，所有的东西都不用换，就把premix换成SB Green1就可以了。
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7楼2011-04-03 17:00:46
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friend.11

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by dreaming0816 at 2011-04-03 17:00:46:
半定量的工作量其实比定量的工作量还要大，建议做定量，所有的东西都不用换，就把premix换成SB Green1就可以了。

还要重新设引物吧！
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8楼2011-04-04 14:56:49
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friend.11

金虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by dreaming0816 at 2011-04-03 16:58:59:
半定量要把目的片段与内参放在一个管内做PCR和电泳的。

放在一管里面引物会竞争模板吧！
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9楼2011-04-04 14:57:55
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jhu132llh

荣誉版主 (知名作家)
★ ★
friend.11(金币+2): 谢谢！ 2011-04-06 10:51:02
看天(金币+2): 鼓励 2011-04-06 12:53:51
引用回帖:
Originally posted by friend.11 at 2011-03-30 20:52:40:
我做半定量PCR相看基因表达量的变化趋势，上调、下调或者不变。做半定量PCR做了很久，每一个基因都重复做了好几次，可是结果相当的不稳定，一个基因有时候上调，有时候下调。我都不知道该怎么分析结果。烦哪！！！ ...

做半定量是很麻烦的事情
首先你得保证每个PCR反应之间的操作手法还有胶什么的没有什么太大的差异的，说白了，就是你的手法首先要稳定；
其次，照胶的影响也是挺大的，因为软件存在一个识别问题；
再次，你做半定量分析的时候，软件的使用也会挺有影响的，同样一块区域，选区大点和小点可能就会有差异，建议手动校正选区。

实在不行，就该定量吧，现在定量试剂盒都很成熟了，并且，定量的数据好发文章
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10楼2011-04-05 17:01:22
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liujie2008

金虫 (小有名气)
friend.11(金币+1): 能说说你后面“没变化”是改变了什么没？ 2011-04-06 10:47:24
引用回帖:
Originally posted by friend.11 at 2011-03-30 20:52:40:
我做半定量PCR相看基因表达量的变化趋势，上调、下调或者不变。做半定量PCR做了很久，每一个基因都重复做了好几次，可是结果相当的不稳定，一个基因有时候上调，有时候下调。我都不知道该怎么分析结果。烦哪！！！ ...

我跟你你的情况一样，本来做的有变化，重复一下没有变化了
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11楼2011-04-05 23:25:55
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kinda_

铁虫 (小有名气)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
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我做定量PCR也是这样的，本来有变化的，可是重复的时候，有时候有变化，有时候不变，做了十来次了...这种结果怎么办啊？该怎么取舍？请教各位高人了！！
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12楼2012-06-05 15:11:19
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kinda_

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
1266612楼: Originally posted by kinda_ at 2012-06-05 15:11:19
我做定量PCR也是这样的，本来有变化的，可是重复的时候，有时候有变化，有时候不变，做了十来次了...这种结果怎么办啊？该怎么取舍？请教各位高人了！！

我的变化倍数很少，才2-3倍，会不会这种变化本身就不可靠呢？
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13楼2012-06-05 15:12:30
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