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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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friend.11

金虫 (正式写手)


[交流] 【求助/交流】急!半定量PCR结果太不稳定

我做半定量PCR相看基因表达量的变化趋势,上调、下调或者不变。做半定量PCR做了很久,每一个基因都重复做了好几次,可是结果相当的不稳定,一个基因有时候上调,有时候下调。我都不知道该怎么分析结果。烦哪!!!有没有做过半定量的朋友提供一点经验,帮帮忙啊!
先谢过了!由于之前散尽了金币,现在金币较少,我会逐渐加上去的!请大家帮帮忙!

[ Last edited by friend.11 on 2011-3-31 at 19:57 ]
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咸鱼

金虫 (小有名气)


★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 感谢分享经验~ 2011-03-30 22:50:13
friend.11(金币+2): 你说的是定量!不过还是谢谢你! 2011-03-31 19:46:44
我做过Real-time,我的基因每次做都挺稳定,你每次加样,操作都没问题吗?不过我们一个师兄芯片数据,我看有好多基因,三组数据之间结果也不稳定,有的上调,有的下调。我自己觉得这样的话,如果上调下调变化不大,是不是可以说基本上是对你所说的那个因素是不敏感的。它的不稳定只是因为环境或其他因素影响。至少跟那个因素之间没有直接关系,或者有也不是在基因水平,而是蛋白水平了吧。
2楼2011-03-30 21:07:43
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65900931

银虫 (小有名气)


friend.11(金币+2): 谢谢! 2011-03-31 19:55:28
做real time,重复三次,每次pcr做triplicate。主要看增加倍数和sd,用统计学方法分析差异的显著性。
3楼2011-03-30 21:17:49
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hwlightning

铜虫 (初入文坛)


friend.11(金币+1): 2011-04-03 16:48:03
做定量PCR
4楼2011-04-03 13:50:49
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rb

木虫 (著名写手)


friend.11(金币+1): 2011-04-03 16:48:24
现在半定量已经很少采用了。如果做半定量,那么起始浓度的标化非常重要。使用的PCR仪要固定,mix要同一批。还是建议用实时定量PCR不会比半定量贵多少,结果还更可靠。
5楼2011-04-03 16:04:52
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dreaming0816

金虫 (著名写手)


friend.11(金币+1): 2011-04-04 14:57:19
半定量要把目的片段与内参放在一个管内做PCR和电泳的。
6楼2011-04-03 16:58:59
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dreaming0816

金虫 (著名写手)


friend.11(金币+2): 2011-04-04 14:56:58
半定量的工作量其实比定量的工作量还要大,建议做定量,所有的东西都不用换,就把premix换成SB Green1就可以了。
7楼2011-04-03 17:00:46
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friend.11

金虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by dreaming0816 at 2011-04-03 17:00:46:
半定量的工作量其实比定量的工作量还要大,建议做定量,所有的东西都不用换,就把premix换成SB Green1就可以了。

还要重新设引物吧!
8楼2011-04-04 14:56:49
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friend.11

金虫 (正式写手)


引用回帖:
Originally posted by dreaming0816 at 2011-04-03 16:58:59:
半定量要把目的片段与内参放在一个管内做PCR和电泳的。

放在一管里面引物会竞争模板吧!
9楼2011-04-04 14:57:55
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★ ★
friend.11(金币+2): 谢谢! 2011-04-06 10:51:02
看天(金币+2): 鼓励 2011-04-06 12:53:51
引用回帖:
Originally posted by friend.11 at 2011-03-30 20:52:40:
我做半定量PCR相看基因表达量的变化趋势,上调、下调或者不变。做半定量PCR做了很久,每一个基因都重复做了好几次,可是结果相当的不稳定,一个基因有时候上调,有时候下调。我都不知道该怎么分析结果。烦哪!!! ...

做半定量是很麻烦的事情
首先你得保证每个PCR反应之间的操作手法还有胶什么的没有什么太大的差异的,说白了,就是你的手法首先要稳定;
其次,照胶的影响也是挺大的,因为软件存在一个识别问题;
再次,你做半定量分析的时候,软件的使用也会挺有影响的,同样一块区域,选区大点和小点可能就会有差异,建议手动校正选区。

实在不行,就该定量吧,现在定量试剂盒都很成熟了,并且,定量的数据好发文章
10楼2011-04-05 17:01:22
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liujie2008

金虫 (小有名气)


friend.11(金币+1): 能说说你后面“没变化”是改变了什么没? 2011-04-06 10:47:24
引用回帖:
Originally posted by friend.11 at 2011-03-30 20:52:40:
我做半定量PCR相看基因表达量的变化趋势,上调、下调或者不变。做半定量PCR做了很久,每一个基因都重复做了好几次,可是结果相当的不稳定,一个基因有时候上调,有时候下调。我都不知道该怎么分析结果。烦哪!!! ...

我跟你你的情况一样,本来做的有变化,重复一下没有变化了
11楼2011-04-05 23:25:55
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kinda_

铁虫 (小有名气)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
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我做定量PCR也是这样的,本来有变化的,可是重复的时候,有时候有变化,有时候不变,做了十来次了...这种结果怎么办啊?该怎么取舍?请教各位高人了!!
12楼2012-06-05 15:11:19
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kinda_

铁虫 (小有名气)


引用回帖:
1266612楼: Originally posted by kinda_ at 2012-06-05 15:11:19
我做定量PCR也是这样的,本来有变化的,可是重复的时候,有时候有变化,有时候不变,做了十来次了...这种结果怎么办啊?该怎么取舍?请教各位高人了!!

我的变化倍数很少,才2-3倍,会不会这种变化本身就不可靠呢?
13楼2012-06-05 15:12:30
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