应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

Znn3bq.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体构建问题
111/2返回列表12下一页
查看: 1382  |  回复: 10
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

飘洋2008

木虫 (著名写手)

[求助] 载体构建问题

本人初次做分子生物学，想将一目的基因约500bp,构建到PBI121载体上，计划先将目标片段加上酶切位点后连接到T载体上，再经双酶切后连到PBI121载体上，连到T载体后才发现酶切位点设计有问题，我设的酶切位点是XbaI/SacI，T载体上也有XbaI/SacI酶切位点，没办法完整切下目标片段，现在我该怎么做？能不能讲目标片段胶回收后直接连到经双酶切后连到PBI121载体上？请哪位高手能指点迷津，本人将不胜感激！
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2013-07-19 17:26:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

幽魂银龙

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
飘洋2008(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-20 10:49:01
为什么不直接连PBI121载体
赞一下 回复此楼
2楼2013-07-19 19:28:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

幽魂银龙

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

问题不大，可以直接酶切后连到PBI121载体上
赞一下 回复此楼
3楼2013-07-19 19:29:35
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘洋2008

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 幽魂银龙 at 2013-07-19 19:29:35
问题不大，可以直接酶切后连到PBI121载体上

你是说把连接好T载体的质粒酶切还是将目标片段酶切了连到PBI121载体上，如果是前者，根本行不通，直接将连接T载体的质粒切成2半了，后者者话能连到PBI121载体上吗？我是初学者，请分步详细说明。
赞一下 回复此楼
4楼2013-07-19 22:15:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
飘洋2008: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 感谢专家指点！ 2013-07-20 05:56:12
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。热心的顾问 2013-07-20 10:49:56
既然设计了酶切位点，直接把纯化后PCR产物酶切连接到PBI121，没必要通过T载体了。我觉得如果不是克隆大量PCR产物，用不用T载体无所谓。
赞一下 回复此楼
5楼2013-07-20 05:28:48
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lillian菲

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
飘洋2008(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-20 12:05:49
同意楼上的，不用连接在T载体上了，设计了带酶切位点的上下游引物，要切记设计的酶切位点在PBI121载体上的多克隆位点处，且只能有一个酶切位点，不会切断原质粒。直接连接在PBI121上就可以了，很容易的啊（T载体不用设计啊，直接PCR之后做酶连就可以啦）
赞一下 回复此楼
6楼2013-07-20 10:09:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

飘洋2008

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lillian菲 at 2013-07-20 10:09:22
同意楼上的，不用连接在T载体上了，设计了带酶切位点的上下游引物，要切记设计的酶切位点在PBI121载体上的多克隆位点处，且只能有一个酶切位点，不会切断原质粒。直接连接在PBI121上就可以了，很容易的啊（T载体不用 ...

你的意思是将设计了酶切位点的PCR产物不用再做酶切，直接连接在PBI121酶切回收的大片段上就可以了吗？
赞一下 回复此楼
7楼2013-07-20 10:44:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

tiny_C

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 飘洋2008 at 2013-07-20 10:44:02
你的意思是将设计了酶切位点的PCR产物不用再做酶切，直接连接在PBI121酶切回收的大片段上就可以了吗？...

你的引物上不是设计了酶切位点吗，PCR之后电泳凝胶回收，回收产物双酶切，同时PBI121也双酶切；双酶切之后分别电泳凝胶回收，回收的产物就可以连接了
赞一下 回复此楼
8楼2013-07-21 12:22:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

lifuzhu3838

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-21 23:08:07
gyesang: 回帖置顶 2013-07-21 23:08:09
一般有两种方法，第一就是楼主做的，引物加上酶切位点，Taq酶扩增连T载体，酶切。还有就是虫友回复的，但是这里的引物还是有点不一样的，想酶切PCR产物，最好加上保护碱基。
这一步酶切是否切开你是检测不了的，所以直到你最后转化才能看出来，如果长出菌落，你都不知道是哪里出的问题。如果长出菌落了，也很难说。分子这东西比较微观，每一步都验证对了，再往下做比较好。
不知道你的引物有没有加保护碱基，如果没有，最好重新设计引物吧
赞一下 回复此楼
活到老学到老
9楼2013-07-21 13:25:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ctt1984

木虫 (正式写手)

初学者
★ ★
飘洋2008(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-21 23:08:24
1,如果你是加了保护碱基，那么对PCR产物胶回收之后直接连接到同样酶切的载体上；
2.片段连接到T载体上之后过夜酶切，尽管你有重复酶切位点，你切得时间足够长，会把所有位点都切开的，只要胶回收和你目的片段一样长的就可以。
赞一下 回复此楼
好好做事，踏实做人！
10楼2013-07-21 14:28:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 飘洋2008 的主题更新
111/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 求调剂学校 +14 不会吃肉 2026-04-13 16/800 2026-04-15 21:59 by noqvsozv
[考研] 求调剂 +11 小聂爱学习 2026-04-11 15/750 2026-04-15 21:57 by noqvsozv
[考研] 085801电气专硕272求调剂 +19 电气李 2026-04-13 21/1050 2026-04-15 13:37 by 黑科技矿业
[考研] 297工科调剂? +14 河南农业大学-能 2026-04-13 15/750 2026-04-15 13:25 by 黑科技矿业
[考研] 复试调剂 +21 积极向上； 2026-04-10 23/1150 2026-04-15 12:50 by 西北望—风沙
[考研] 272分材料子求调剂 +41 Loy0361 2026-04-10 54/2700 2026-04-14 18:00 by lhj2009
[考研] 人工智能320调剂08工类还有机会吗 +18 振—TZ 2026-04-10 19/950 2026-04-14 10:34 by screening
[考研] 300分求调剂 （085501机械专硕，本科扬大） +9 xu@841019 2026-04-11 10/500 2026-04-14 08:48 by 木木mumu～
[考研] 0856专硕求调剂 希望是a区院校 +24 好好休息好不好 2026-04-09 27/1350 2026-04-13 22:22 by pies112
[基金申请] 2026 WR青拔 +3 冬日阳光CAS 2026-04-09 6/300 2026-04-13 18:40 by liuchb715
[考研] 0831一轮调剂失败求助 +10 小熊睿睿_s 2026-04-11 10/500 2026-04-12 22:43 by 长弓傲
[考研] 材料与化工300求调剂 +39 肖开文 2026-04-09 43/2150 2026-04-12 01:30 by 秋豆菜芽
[考研] 283求调剂 +22 那个噜子 2026-04-09 22/1100 2026-04-11 10:41 by 逆水乘风
[考研] 297求调剂 +9 Kwgyz 2026-04-09 9/450 2026-04-11 10:09 by zhq0425
[考研] 281求调剂 +11 觉得好的吧 2026-04-10 11/550 2026-04-11 09:35 by 逆水乘风
[考研] 337求调剂 +4 研s. 2026-04-10 4/200 2026-04-11 08:57 by zhq0425
[考研] 考研调剂 +26 硕星赴 2026-04-09 27/1350 2026-04-10 22:24 by 猪会飞
[考研] 265求调剂 +12 风说她早忘了 2026-04-10 13/650 2026-04-10 18:56 by chemisry
[考研] 本9 一志愿西工大085601 324求调剂 +5 wysyjs25 2026-04-10 5/250 2026-04-10 16:57 by luoyongfeng
[考研] 085800 能源动力求调剂 +6 阿biu啊啊啊啊啊 2026-04-10 6/300 2026-04-10 15:03 by hemengdong
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭