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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体构建问题
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飘洋2008

金虫 (著名写手)

[求助] 载体构建问题

本人初次做分子生物学，想将一目的基因约500bp,构建到PBI121载体上，计划先将目标片段加上酶切位点后连接到T载体上，再经双酶切后连到PBI121载体上，连到T载体后才发现酶切位点设计有问题，我设的酶切位点是XbaI/SacI，T载体上也有XbaI/SacI酶切位点，没办法完整切下目标片段，现在我该怎么做？能不能讲目标片段胶回收后直接连到经双酶切后连到PBI121载体上？请哪位高手能指点迷津，本人将不胜感激！
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1楼 2013-07-19 17:26:34
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lifuzhu3838

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-21 23:08:07
gyesang: 回帖置顶 2013-07-21 23:08:09
一般有两种方法，第一就是楼主做的，引物加上酶切位点，Taq酶扩增连T载体，酶切。还有就是虫友回复的，但是这里的引物还是有点不一样的，想酶切PCR产物，最好加上保护碱基。
这一步酶切是否切开你是检测不了的，所以直到你最后转化才能看出来，如果长出菌落，你都不知道是哪里出的问题。如果长出菌落了，也很难说。分子这东西比较微观，每一步都验证对了，再往下做比较好。
不知道你的引物有没有加保护碱基，如果没有，最好重新设计引物吧
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活到老学到老
9楼2013-07-21 13:25:52
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幽魂银龙

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
飘洋2008(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-20 10:49:01
为什么不直接连PBI121载体
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2楼2013-07-19 19:28:04
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幽魂银龙

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

问题不大，可以直接酶切后连到PBI121载体上
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3楼2013-07-19 19:29:35
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飘洋2008

金虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 幽魂银龙 at 2013-07-19 19:29:35
问题不大，可以直接酶切后连到PBI121载体上

你是说把连接好T载体的质粒酶切还是将目标片段酶切了连到PBI121载体上，如果是前者，根本行不通，直接将连接T载体的质粒切成2半了，后者者话能连到PBI121载体上吗？我是初学者，请分步详细说明。
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4楼2013-07-19 22:15:56
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