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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 载体构建问题
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飘洋2008

金虫 (著名写手)

[求助] 载体构建问题

本人初次做分子生物学，想将一目的基因约500bp,构建到PBI121载体上，计划先将目标片段加上酶切位点后连接到T载体上，再经双酶切后连到PBI121载体上，连到T载体后才发现酶切位点设计有问题，我设的酶切位点是XbaI/SacI，T载体上也有XbaI/SacI酶切位点，没办法完整切下目标片段，现在我该怎么做？能不能讲目标片段胶回收后直接连到经双酶切后连到PBI121载体上？请哪位高手能指点迷津，本人将不胜感激！
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1楼 2013-07-19 17:26:34
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幽魂银龙

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
飘洋2008(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。 2013-07-20 10:49:01
为什么不直接连PBI121载体
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2楼2013-07-19 19:28:04
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幽魂银龙

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

问题不大，可以直接酶切后连到PBI121载体上
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3楼2013-07-19 19:29:35
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飘洋2008

金虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 幽魂银龙 at 2013-07-19 19:29:35
问题不大，可以直接酶切后连到PBI121载体上

你是说把连接好T载体的质粒酶切还是将目标片段酶切了连到PBI121载体上，如果是前者，根本行不通，直接将连接T载体的质粒切成2半了，后者者话能连到PBI121载体上吗？我是初学者，请分步详细说明。
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4楼2013-07-19 22:15:56
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
飘洋2008: 金币+5, ★★★★★最佳答案, 感谢专家指点！ 2013-07-20 05:56:12
myprayer: 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，分子生物期待你的更多精彩。热心的顾问 2013-07-20 10:49:56
既然设计了酶切位点，直接把纯化后PCR产物酶切连接到PBI121，没必要通过T载体了。我觉得如果不是克隆大量PCR产物，用不用T载体无所谓。
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5楼2013-07-20 05:28:48
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lillian菲

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
飘洋2008(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-20 12:05:49
同意楼上的，不用连接在T载体上了，设计了带酶切位点的上下游引物，要切记设计的酶切位点在PBI121载体上的多克隆位点处，且只能有一个酶切位点，不会切断原质粒。直接连接在PBI121上就可以了，很容易的啊（T载体不用设计啊，直接PCR之后做酶连就可以啦）
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6楼2013-07-20 10:09:22
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飘洋2008

金虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by lillian菲 at 2013-07-20 10:09:22
同意楼上的，不用连接在T载体上了，设计了带酶切位点的上下游引物，要切记设计的酶切位点在PBI121载体上的多克隆位点处，且只能有一个酶切位点，不会切断原质粒。直接连接在PBI121上就可以了，很容易的啊（T载体不用 ...

你的意思是将设计了酶切位点的PCR产物不用再做酶切，直接连接在PBI121酶切回收的大片段上就可以了吗？
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7楼2013-07-20 10:44:02
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tiny_C

银虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 飘洋2008 at 2013-07-20 10:44:02
你的意思是将设计了酶切位点的PCR产物不用再做酶切，直接连接在PBI121酶切回收的大片段上就可以了吗？...

你的引物上不是设计了酶切位点吗，PCR之后电泳凝胶回收，回收产物双酶切，同时PBI121也双酶切；双酶切之后分别电泳凝胶回收，回收的产物就可以连接了
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8楼2013-07-21 12:22:21
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lifuzhu3838

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-21 23:08:07
gyesang: 回帖置顶 2013-07-21 23:08:09
一般有两种方法，第一就是楼主做的，引物加上酶切位点，Taq酶扩增连T载体，酶切。还有就是虫友回复的，但是这里的引物还是有点不一样的，想酶切PCR产物，最好加上保护碱基。
这一步酶切是否切开你是检测不了的，所以直到你最后转化才能看出来，如果长出菌落，你都不知道是哪里出的问题。如果长出菌落了，也很难说。分子这东西比较微观，每一步都验证对了，再往下做比较好。
不知道你的引物有没有加保护碱基，如果没有，最好重新设计引物吧
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活到老学到老
9楼2013-07-21 13:25:52
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ctt1984

木虫 (正式写手)

初学者
★ ★
飘洋2008(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-21 23:08:24
1,如果你是加了保护碱基，那么对PCR产物胶回收之后直接连接到同样酶切的载体上；
2.片段连接到T载体上之后过夜酶切，尽管你有重复酶切位点，你切得时间足够长，会把所有位点都切开的，只要胶回收和你目的片段一样长的就可以。
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好好做事，踏实做人！
10楼2013-07-21 14:28:33
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