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飘洋2008金虫 (著名写手)
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载体构建问题
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| 本人初次做分子生物学，想将一目的基因约500bp,构建到PBI121载体上，计划先将目标片段加上酶切位点后连接到T载体上，再经双酶切后连到PBI121载体上，连到T载体后才发现酶切位点设计有问题，我设的酶切位点是XbaI/SacI，T载体上也有XbaI/SacI酶切位点，没办法完整切下目标片段，现在我该怎么做？能不能讲目标片段胶回收后直接连到经双酶切后连到PBI121载体上？请哪位高手能指点迷津，本人将不胜感激！ |
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【答案】应助回帖
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gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-21 23:08:07
gyesang: 回帖置顶 2013-07-21 23:08:09
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一般有两种方法，第一就是楼主做的，引物加上酶切位点，Taq酶扩增连T载体，酶切。还有就是虫友回复的，但是这里的引物还是有点不一样的，想酶切PCR产物，最好加上保护碱基。 这一步酶切是否切开你是检测不了的，所以直到你最后转化才能看出来，如果长出菌落，你都不知道是哪里出的问题。如果长出菌落了，也很难说。分子这东西比较微观，每一步都验证对了，再往下做比较好。 不知道你的引物有没有加保护碱基，如果没有，最好重新设计引物吧 |
9楼2013-07-21 13:25:52
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