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hb467116237

金虫 (小有名气)

[求助] 转化长不出来菌

微生物的虫虫们看过来 ,帮我解决下这个问题:我构建的载体大小在16~17kb之间,转ET12567/pUZ8002,重复了好几次都长不出菌来。用的质粒量分别有2、5、10微,是钙转的感受态。不知道什么原因,这步做不出来,实验就没法进行了,捉急啊。
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hb467116237

金虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by pangenlaozhu at 2013-07-29 13:47:03
感受态细胞有没有问题,可以买点市售的,如果不是用大肠,那么热激的条件应该要调整吧,还有平板抗生素的浓度,质粒片段的大小都是有影响的,祝你实验顺利。

谢谢,后来实验做出来了 ,可能片段大小有点大,加上使用了三种抗生素,所以转化效率有点低,菌长得少而且时间长。
10楼2013-07-29 19:31:23
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
hb467116237: 金币+2 2013-07-18 12:33:11
laozuzunzhe: 金币+1, 鼓励应助! 2013-07-18 16:48:42
大载体用电转化比较好,熱激对大片段的效率比较低。
2楼2013-07-18 10:09:05
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hb467116237

金虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-07-18 10:09:05
大载体用电转化比较好,熱激对大片段的效率比较低。

我试试看,谢了
3楼2013-07-18 12:32:38
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风之游魂

新虫 (初入文坛)


【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
不知道你用的是什么菌株?有些菌株因为本身细胞壁厚度问题就很难转化,比如枯草芽孢杆菌,得用特殊的方法
4楼2013-07-19 08:45:45
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hb467116237

金虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by 风之游魂 at 2013-07-19 08:45:45
不知道你用的是什么菌株?有些菌株因为本身细胞壁厚度问题就很难转化,比如枯草芽孢杆菌,得用特殊的方法

我是以pOJ446克隆出来一个载体,连有tsr的抗性基因,后边要做大片段缺失。
5楼2013-07-19 10:22:39
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hb467116237

金虫 (小有名气)

还有一点是我用了三种抗生素,那么生长的时间是不是会长一些,约17h左右。
6楼2013-07-20 09:53:53
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499649610

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
hb467116237: 金币+2, ★★★很有帮助 2013-07-22 10:45:59
转化平板 采用的抗生素浓度比较低(但能够抑制野生型时),会有较高的转化效率,相当于一个诱导表达的过程! 其次,不知道你是转到什么菌种,有的菌 会自己形成一层膜,感受态细胞很难制作,因而也就很难转进去。 还有就是,有的菌自带某些内切酶修饰系统,有文献说 有些菌转化时,把质粒先甲基化会更好,但不知到对后续试验是否有影响!
7楼2013-07-20 15:47:33
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hb467116237

金虫 (小有名气)

引用回帖:
7楼: Originally posted by 499649610 at 2013-07-20 15:47:33
转化平板 采用的抗生素浓度比较低(但能够抑制野生型时),会有较高的转化效率,相当于一个诱导表达的过程! 其次,不知道你是转到什么菌种,有的菌 会自己形成一层膜,感受态细胞很难制作,因而也就很难转进去。 还 ...

我是用pOJ446构建的载体,后边要做大片段缺失。感受态细胞是ET12567,以前转pIB139的时候效率很高,同样是使用了三种抗生素,但是不知道这次为什么这么低
8楼2013-07-22 10:49:39
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pangenlaozhu

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


hb467116237: 金币+1 2013-07-29 19:31:57
感受态细胞有没有问题,可以买点市售的,如果不是用大肠,那么热激的条件应该要调整吧,还有平板抗生素的浓度,质粒片段的大小都是有影响的,祝你实验顺利。
选择比努力重要
9楼2013-07-29 13:47:03
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