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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 原核表达相关操作
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sls19881024

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达相关操作

大家在做原核表达的时候有没有遇到连接不上的情况啊   双酶切的条带都很单一，T4 ligase连接过夜后，涂平板不长菌斑咋回事啊？
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小松
1楼 2013-07-04 21:47:27
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★ ★
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gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助！ 2013-07-04 22:19:43
1，载体和插入片段要有一定mol比。。否则很难连上去。，建议载体0.03pmol。插入片段0.3pmol。。这样会很容易
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2楼2013-07-04 21:56:53
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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sls19881024: 金币+5, ★有帮助 2013-07-05 09:18:24
你用哪个酶做的digestion？
先判断一下你的酶切是不是做的好，再去看ligation会比较好。Ligation的失败和很多的东西都相关的
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3楼2013-07-05 08:19:16
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sls19881024

银虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lwiaanngg at 2013-07-05 08:19:16
你用哪个酶做的digestion？
先判断一下你的酶切是不是做的好，再去看ligation会比较好。Ligation的失败和很多的东西都相关的

用的是sal I和Ham I双酶切的，切得条带还是很单一的，就是连接后都不长菌，加的kana是50ug/ml的
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小松
4楼2013-07-05 09:18:06
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bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
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gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助！ 2013-07-05 15:07:51
sls19881024: 金币+5, ★有帮助 2013-07-06 07:45:48
连接就是这样的，首先你要优化体系、操作，然后有时真的是靠运气的。。。。

建议：1.像楼上说的，确定酶切没问题
         2.优化片段与质粒的配比，可以多做几个配比的同时连接过夜
         3.16度或22度（根据连接酶来确定）连接过夜后，转一批；剩下的继续4度连接几小时转一批；甚至4度连接1天以后都可以试一下的
         4.最后确定抗生素、浓度是否正确
         5.祈求好运。。。
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岂能尽如人意，但求无愧我心
5楼2013-07-05 10:49:20
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游侠892

铁杆木虫 (著名写手)

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sls19881024: 金币+5, ★有帮助 2013-07-06 07:46:05
涂平板不长，如果抗生素没用错的话，说明载体肯定是切开了，那估计就是连接没有做好了。多试试几个载体与目标片段的比例，或试试4度连接过夜等
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路漫漫其修远兮，吾将上下而求索
6楼2013-07-05 18:26:13
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