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sls19881024

银虫 (小有名气)

[求助] 原核表达相关操作

大家在做原核表达的时候有没有遇到连接不上的情况啊   双酶切的条带都很单一,T4 ligase连接过夜后,涂平板不长菌斑咋回事啊?
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小松
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bleach060452

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+3, 鼓励回帖应助! 2013-07-05 15:07:51
sls19881024: 金币+5, ★有帮助 2013-07-06 07:45:48
连接就是这样的,首先你要优化体系、操作,然后有时真的是靠运气的。。。。

建议:1.像楼上说的,确定酶切没问题
         2.优化片段与质粒的配比,可以多做几个配比的同时连接过夜
         3.16度或22度(根据连接酶来确定)连接过夜后,转一批;剩下的继续4度连接几小时转一批;甚至4度连接1天以后都可以试一下的
         4.最后确定抗生素、浓度是否正确
         5.祈求好运。。。
岂能尽如人意,但求无愧我心
5楼2013-07-05 10:49:20
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武穆大成

木虫 (著名写手)

笨蛋

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖应助! 2013-07-04 22:19:43
1,载体和插入片段要有一定mol比。。否则很难连上去。,建议载体0.03pmol。插入片段0.3pmol。。这样会很容易
2楼2013-07-04 21:56:53
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lwiaanngg

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
sls19881024: 金币+5, ★有帮助 2013-07-05 09:18:24
你用哪个酶做的digestion?
先判断一下你的酶切是不是做的好,再去看ligation会比较好。Ligation的失败和很多的东西都相关的
3楼2013-07-05 08:19:16
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sls19881024

银虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lwiaanngg at 2013-07-05 08:19:16
你用哪个酶做的digestion?
先判断一下你的酶切是不是做的好,再去看ligation会比较好。Ligation的失败和很多的东西都相关的

用的是sal I和Ham I双酶切的,切得条带还是很单一的,就是连接后都不长菌,加的kana是50ug/ml的
小松
4楼2013-07-05 09:18:06
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